Micro modulaire

Microsystèmes & Nanoingénierie volume 8, Numéro d'article : 82 (2022) Citer cet article

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Un confinement efficace de la pandémie de COVID-19 nécessite une détection rapide et précise de l'agent pathogène. La réaction en chaîne par polymérase (PCR) reste l'étalon-or pour la confirmation COVID-19. Dans cet article, nous rapportons les performances d'une plate-forme modulaire rentable de transcription inverse microfluidique (RT)-PCR et d'amplification isotherme médiée par boucle RT (RT-LAMP), Epidax®, pour les tests au point de service et la confirmation du SARS-CoV-2. Cette plate-forme est polyvalente et peut être reconfigurée soit pour le dépistage à l'aide de tests RT-PCR ou RT-LAMP en point final, soit pour des tests de confirmation à l'aide de la RT-PCR en temps réel. Epidax® est très sensible et détecte aussi peu qu'une copie d'ARN par µL pour la RT-PCR en temps réel et en point final, tout en n'utilisant que la moitié des réactifs. Nous avons obtenu des résultats comparables à ceux d'une plateforme commerciale lors de la détection des virus SARS-CoV-2 à partir de 81 extraits d'ARN cliniques. Epidax® peut également détecter le SRAS-CoV-2 à partir de 44 échantillons nasopharyngés sans extraction d'ARN en utilisant un test RT-PCR direct, ce qui réduit le temps entre l'échantillon et la réponse à une heure avec un minimum d'étapes de l'utilisateur. De plus, nous avons validé la technologie à l'aide d'un test RT-LAMP sur 54 extraits d'ARN cliniques. Dans l'ensemble, notre plate-forme fournit une solution de diagnostic sensible, rentable et précise pour les environnements à faibles ressources.

Depuis son émergence en décembre 2019, le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) s'est propagé dans le monde entier, provoquant des décès, des maladies et des perturbations dans la vie et les entreprises.

Un contrôle efficace de la pandémie de COVID-19 nécessite une détection rapide et précise du virus. La publication initiale du génome du SRAS-CoV-2 en janvier 2020 a permis aux entreprises et aux laboratoires du monde entier de développer divers tests et techniques pour le diagnostic du COVID-191,2,3. L'amplification en chaîne par polymérase-transcription inverse en temps réel (RT-PCR) reste l'étalon-or pour l'identification du SRAS-CoV-2. Comme un programme de test complet nécessiterait probablement un dépistage à la fois largement accessible et rapide en combinaison avec des tests de confirmation PCR très sensibles, il est nécessaire de disposer de méthodes alternatives pour identifier les personnes infectées qui soient suffisamment peu coûteuses, portables et efficaces pour permettre un diagnostic rapide au point d'utilisation. Ces tests au point de service (POC) sont un outil important à déployer aux frontières pour ouvrir les voyages et les économies internationales.

Divers tests commerciaux en laboratoire et POC ont été déployés dans le monde : Cepheid® Xpert® Xpress SARS-CoV-24, cobas® SARS-CoV-25 de Roche, GenMark ePlex® SARS-CoV-26, test COVIDNudge de DnaNudge7,8, Abbott ID Now COVID-199 et autres10. Les trois premiers sont des systèmes entièrement automatisés pour le test d'échantillons multiples avec une sensibilité élevée, par exemple, il a été rapporté que Xpert® Xpress a atteint une sensibilité de 98,3 % dans leur test PCR de 46 minutes11. Cependant, l'équipement est coûteux et a une grande empreinte, ce qui limite les tests à grande échelle et les utilisations dans des environnements à faibles ressources. COVIDNudge est une plateforme de RT-PCR sans laboratoire qui peut détecter sept cibles virales (RdRp1, RdRp2, gène E, gène N, N1, N2 et N3) et un contrôle (ribonucléase P), avec une sensibilité de 94 % dans un test de 90 minutes8. Cependant, le nombre excessif de puits requis pour un échantillon (72 puits) augmente la complexité de l'opération et rend le test sujet aux erreurs de manipulation et d'interprétation. Les tests POC approuvés par la FDA utilisant une amplification isotherme, tels que Abbott ID Now COVID-19, peuvent détecter des échantillons positifs en aussi peu que 5 minutes et des résultats négatifs en 13 minutes à l'aide d'un petit appareil portable12. Bien que cette approche permette d'obtenir des résultats rapides, des rapports font état d'une précision et d'une sensibilité limitées des tests11,13.

L'utilisation de la microfluidique pour les tests de diagnostic, en particulier dans un contexte POC, est avantageuse car elle permet de tester en utilisant une quantité infime d'échantillon, permettant potentiellement une détection et un déploiement plus rapides avec moins de réactifs14. Il y a eu de nombreux développements dans les systèmes de PCR microfluidique15. Certaines conceptions offrent plusieurs fonctions sur puce pour la préparation et la détection des échantillons. Cependant, ces systèmes ne sont pas modulaires et ont encore des défis à surmonter pour un déploiement sur le terrain. La plupart des puces PCR sont en verre, en PDMS ou en plastique, qui ont une faible conductivité thermique et ne conviennent pas aux applications nécessitant un contrôle rapide et précis de la température dans le canal microfluidique16. Pour surmonter cette limitation, les réactifs pourraient être déplacés vers des régions de la puce qui sont préchauffées à la température souhaitée pour la PCR. Ceci a été réalisé soit en utilisant un système à flux continu avec de multiples zones préchauffées17,18 soit en cyclant les réactifs entre les zones préchauffées16. Cependant, ces méthodes nécessitent des pousse-seringues programmables de haute précision qui rendent le système encombrant et inadapté aux paramètres POC. De plus, le chauffage multizone augmente la complexité des puces, ce qui pose un défi pour la production de masse. Ce problème est amplifié si plusieurs chambres de réaction (par exemple, pour accueillir des contrôles négatifs, positifs et internes) sont nécessaires sur une puce. La microfluidique permet également l'utilisation de volumes infimes, ce qui réduit le volume de réactifs nécessaires. Ceci est particulièrement important dans une pandémie qui perturbe la chaîne d'approvisionnement des réactifs de test. Il a été démontré qu'un laboratoire sur puce microfluidique est capable d'effectuer une PCR sur des échantillons avec des volumes de l'ordre du nanolitre, jusqu'à 30 nL19,20. Bien qu'un petit volume puisse réduire l'utilisation de réactifs, un volume trop faible affecterait négativement la sensibilité du test. Ceci est plus prononcé lorsqu'on tente de détecter des cas asymptomatiques dans lesquels l'échantillon d'entrée a un très faible titre de virus. Ces puces de la gamme des nanolitres ne peuvent pas être mises à l'échelle jusqu'aux microlitres en raison de la conception de leur système. En plus de la PCR, des systèmes portables de laboratoire sur puce ont été utilisés pour effectuer une amplification isotherme médiée par une boucle de transcription inverse (RT-LAMP) pour les tests de diagnostic21,22,23,24,25,26. Ces systèmes ne peuvent pas effectuer de PCR en raison de leurs unités de contrôle thermique simplifiées. La plupart ne peuvent pas mesurer la dynamique de la réaction et ne capturent que les résultats finaux. De plus, la RT-LAMP a une sensibilité inférieure à la RT-PCR pour la détection du COVID-191,11,27,28.

Nous avons développé une plateforme microfluidique modulaire de RT-PCR et RT-LAMP en attente de brevet, Epidax®29, pour le diagnostic rapide sur site du SARS-CoV-2. Cette plate-forme de type LEGO comprend un module de température sur puce, un module de détection et un logiciel d'analyse et peut être facilement reconfigurée pour effectuer soit un dépistage du COVID-19 par des tests RT-PCR ou RT-LAMP en point final, soit des tests de confirmation par RT-PCR en temps réel (RT-qPCR). Nous avons établi ses performances dans la détection des virus SARS-CoV-2 à partir de 81 et 43 extraits d'ARN cliniques à l'aide de nos tests configurés RT-PCR et RT-qPCR, respectivement, pour être comparables aux résultats obtenus à l'aide d'un système commercial, mais avec la moitié de la quantité de réactifs utilisés. De plus, nous avons démontré une détection directe rapide par RT-PCR des virus du SRAS-CoV-2 dans 42 échantillons d'écouvillonnage nasopharyngé sans extraction d'ARN, ce qui a réduit le temps de test de l'échantillon au résultat à une heure. Enfin, nous avons effectué la détection du SRAS-CoV-2 dans 54 extraits d'ARN cliniques à l'aide de notre plateforme RT-LAMP reconfigurée. La modularité de la plate-forme permet d'effectuer différents tests en fonction du besoin et de la vitesse du cas d'utilisation.

Le système Epidax® comprend un module de température, une puce microfluidique, un module de détection et un logiciel de traitement et d'analyse d'images (voir Fig. 1a–c). La puce peut être facilement montée sur le module de température et auto-alignée à l'aide d'aimants. La température de l'échantillon dans la puce est contrôlée sur une période de temps pour permettre une réaction d'amplification. Le module de détection comprend une caméra CMOS pour capturer des images fluorescentes de la puce à des moments définis (c'est-à-dire au début et à la fin des cycles pour la PCR en point final ou à la fin de chaque cycle d'amplification pour la PCR en temps réel). Le logiciel de traitement et d'analyse d'images analyse ensuite les images prises. Les réactions sont quantifiées par l'intensité de fluorescence des échantillons. La modularité de la plate-forme offre une flexibilité dans la création de plates-formes de détection pour différents types d'échantillons, cibles de détection, protocoles et exigences de déploiement. Ici, nous avons utilisé avec succès Epidax® pour diverses applications : dépistage du COVID-19 en utilisant la RT-PCR ou la RT-LAMP en point final, un test de confirmation utilisant la RT-PCR en temps réel sur des extraits d'ARN, et un test de dépistage ou de confirmation utilisant un test RT-PCR direct sur des échantillons nasopharyngés sans extraction d'ARN.

un Epidax® en fonctionnement avec le module de détection placé au-dessus de la puce microfluidique et le module de température (pour la RT-PCR en temps réel dans un test de confirmation SARS-CoV-2 dans lequel une image est prise à la fin de chaque cycle d'amplification), et un package d'analyse d'image déployé à l'aide d'un ordinateur portable ; b Epidax® en fonctionnement avec le module de détection détaché (pour RT–PCR ou RT-LAMP en point final dans le dépistage du SARS-CoV-2). Les échantillons et les réactifs sont chargés sur la puce et placés dans le module de température pour un traitement basé sur les protocoles requis ; c Méthode schématique d'exécution de l'ensemble du processus de détection et de diagnostic d Vue éclatée de la puce détaillant ses composants. La plaque de canal contenant le profil de canal pourrait être facilement changée pour de nouvelles applications. La figure montre une plaque à canaux comprenant quatre canaux sous forme de quatre chambres de PCR indépendantes. Il s'agit d'un composant jetable de la puce, alors que d'autres composants peuvent être réutilisables. La plaque de canal se compose d'une fente pour installer un capteur de température pour le contrôle de rétroaction vers l'élément Peltier ; e Une puce à quatre canaux pour RT–PCR. Chaque canal consiste en une entrée alimentant une région en serpentin, suivie d'une région d'expansion et de contraction incurvée formant une chambre en forme d'œil dans laquelle résidera le mélange réactionnel, suivie d'une autre région en serpentin menant à une sortie ; f Une puce à six canaux pour RT-LAMP, démontrant la capacité de tester plus d'échantillons en un seul test.

Le module de température sur puce se compose de la puce microfluidique, d'un élément Peltier assemblé avec une plaque d'espacement et une plaque de support (voir Fig. 1d). Des aimants sont utilisés pour l'assemblage auto-aligné de la puce sur le module thermique, permettant des changements rapides d'échantillons de test. Seule la puce est jetable, alors que l'ensemble du module est réutilisable, ce qui réduit le coût de fonctionnement du système.

La puce comprend une plaque de canal principale et un mince film adhésif en aluminium servant de couche thermiquement conductrice et améliorant le signal fluorescent collecté par le module de détection. L'aluminium a une conductivité thermique de 200 à 237 W/mK, soit quelques ordres de grandeur supérieure à celle du verre, du PDMS et du plastique (généralement moins de 2 W/mK), qui sont traditionnellement utilisés pour fabriquer des microcanaux. La faible épaisseur et la conductivité thermique élevée permettent un taux élevé de transfert de chaleur dans et hors du microcanal. Ceci est très important, car certains protocoles PCR nécessitent un cycle de température rapide. En utilisant le film d'aluminium réfléchissant, la lumière émise par les échantillons fluorescents sera réfléchie vers le module de détection, augmentant le signal qui peut être collecté par rapport à celui obtenu avec un mur transparent (voir Fig. S1 pour la comparaison de l'intensité de fluorescence avec différents matériaux de substrat, tels que le verre transparent et le plastique). Les excellentes caractéristiques thermiques et optiques de la puce permettent diverses applications, notamment la RT-PCR (contrôle thermique cyclique) et la RT-LAMP (contrôle isotherme), pour lesquelles l'utilisation de puces traditionnelles en plastique ou PDMS à parois transparentes est sous-optimale.

La plaque à canaux a été fabriquée à l'aide de polyméthacrylate de méthyle (PMMA) avec des dimensions de 50 mm × 40 mm (L × l). Une fente de capteur et des trous pour les aimants ont été découpés à l'aide d'un laser CO2 (systèmes laser universels). Le capteur de température utilisé était le MP-3176 (TE Technology, Inc.). Le nombre de microcanaux sur la plaque à canaux peut être facilement ajusté pour divers besoins de test. Ici, nous démontrons quatre ou six microcanaux sur une puce, chacun utilisé comme une chambre indépendante, permettant de tester plusieurs échantillons. Pour les expériences RT – PCR, quatre profils de canaux identiques (voir Fig. 1e) ont été gravés à l'aide d'un laser CO2 (Universal Laser Systems) à une profondeur d'environ 720 μm, et le volume total de chaque canal était d'environ 60 μL. Pour les expériences RT-LAMP, des profils à six canaux (voir Fig. 1f) ont été gravés à une profondeur d'environ 1,71 mm, ce qui donne un volume total de canaux d'environ 98 μL. Chaque canal se compose de régions serpentines agissant comme des résistances à l'écoulement et d'une chambre en forme d'œil dans laquelle résidera le mélange réactionnel. Pendant la PCR, la température de l'échantillon peut être augmentée à plus de 90 °C. Les résistances d'écoulement empêchent l'échantillon de sortir de la chambre en raison de l'augmentation de la pression de vapeur de l'échantillon liquide. La région serpentine agit également comme un mélangeur pour améliorer le mélange échantillon-réactif lorsqu'il est injecté dans le microcanal. La chambre en forme d'œil, avec sa courbure ainsi que la présence d'huile, empêche l'échantillon de se briser en plus petites portions dans des conditions de cyclage thermique. De plus, le petit réservoir à chaque entrée et sortie agit comme un captage pour contenir le fluide (huile, etc.) qui pourrait s'écouler du canal en raison de la pression de vapeur causée par les températures élevées. Ces conceptions peuvent être facilement personnalisées en faisant varier la profondeur et la largeur des canaux pour s'adapter à différents volumes. Ici, nous utilisons la moitié d'un volume de PCR standard, qui est de 10 à 12,5 μL, pour la détection sur puce du SARS-CoV-2.

La plaque à canaux a été trempée dans RNase Away (Thermo Fisher), suivie d'un lavage soigneux dans de l'eau sans nucléase et d'un séchage à l'air dans une hotte propre. Un film adhésif en aluminium d'une épaisseur de 36 μm (Excel Scientific) a été utilisé comme film conducteur et fixé à la plaque de canal par application manuelle. L'entretoise a été réalisée par découpe laser de PMMA. La plaque de support a été usinée en utilisant un matériau en cuivre. Le dispositif Peltier a été placé à l'intérieur de l'entretoise, soutenu par la plaque de support. Une couche facultative de pâte thermique (telle que MX-4, Arctic) a été appliquée sur la surface de contact entre la puce et le dispositif Peltier et sur la surface de contact entre le dispositif Peltier et le dissipateur thermique pour améliorer le transfert de chaleur.

Le module de détection comprend une fente pour recevoir la puce, une caméra CMOS (Arducam OV5642) et une source de lumière LED (voir Fig. S1). Il a des dimensions de 110 mm × 60 mm × 90 mm et pesait environ 250 g. La disposition de la caméra a un grand champ de vision de ɸ 40 mm, qui est plus grand que la zone d'échantillonnage ; ainsi, les signaux de tous les canaux de réaction peuvent être capturés simultanément sans mouvement mécanique de la source lumineuse et du système de détection, comme dans d'autres systèmes commerciaux. Ceci diminue avantageusement le temps de détection total et donc le temps de test global. Le module de détection comprend en outre un cube de filtre (incluant un miroir dichroïque, un filtre d'excitation et un filtre d'émission). Le boîtier du module de détection est imprimé en 3D avec des fentes désignées pour les LED, le cube de filtre, la puce et la caméra à l'aide d'acide polylactique. Pour le signal FAM, une lumière LED avec une longueur d'onde maximale de 492 nm, un filtre d'excitation (446–486 nm) et un filtre d'émission (coupure à 520 nm) ont été utilisés. Pour les tests RT-PCR directs, deux modules de détection supplémentaires pour détecter le signal HEX (pic d'excitation à 538 nm, pic d'émission à 555 nm) et le signal Texas Red (pic d'excitation à 596 nm, pic d'émission à 613 nm) ont été fabriqués.

Nous avons développé un logiciel de traitement et d'analyse d'accompagnement pour Epidax® afin de traiter les images prises par le module de détection pour une détection en temps réel ou en point final. Le package interne peut être exécuté en tant que démon pour les expériences RT-qPCR (pour le test de confirmation SARS-CoV-2). Au fur et à mesure que de nouvelles images sont capturées à la fin de chaque cycle, elles suivent la procédure de la Fig. S2a pour générer le tracé d'amplification et déterminer la valeur Ct. La possibilité d'obtenir ces mesures presque en temps réel est importante dans les diagnostics POC, car elle offre la flexibilité d'accélérer le temps entre l'échantillon et le résultat. Par exemple, il peut y avoir un besoin clinique de corréler les valeurs de Ct à la présence de virus infectieux (c'est-à-dire au Ct de 20), et des valeurs de Ct plus élevées peuvent indiquer une excrétion prolongée d'ARN viral par un individu non infectieux30. Si le scénario de test nécessite un diagnostic positif uniquement pour les patients infectieux, l'exécution du test peut être programmée pour s'arrêter lorsque le seuil de détection est atteint avant le cycle 20 ou à une valeur Ct supérieure prédéterminée. Cela améliore considérablement l'efficacité de la détection.

Ce package d'analyse peut également être exécuté comme une application Web pour la RT-PCR en point final (pour le dépistage du COVID-19) afin de fournir un dépistage rapide du SRAS-CoV-2, où la dynamique de l'amplification n'est pas intéressante. Dans ce mode, une image est obtenue avant une réaction d'amplification (cycle 0) et comparée à une image après un certain nombre de cycles d'amplification (par exemple, cycle 45). La différence d'intensité entre ces images (après traitement comme le montre la Fig. S2e) peut être utilisée pour conclure que l'échantillon est positif pour le SRAS-CoV-2 lorsqu'il est supérieur à un seuil de dépistage et négatif dans le cas contraire.

La figure 2a montre diverses méthodes de détection du SRAS-CoV-2 à l'aide d'Epidax®, y compris (a) une analyse RT-qPCR en temps réel pour le test de confirmation du SRAS-CoV-2 ; (b) point final RT-PCR ; et (c) RT-LAMP pour le dépistage. Dans chaque application, des expériences ont été réalisées sur le système Epidax® et comparées à des systèmes PCR commerciaux (c'est-à-dire le cycleur thermique Bio–Rad C1000 Touch et le système de détection qPCR CFX96 de Bio–Rad, appelé « Bio–Rad » dans cet article, et le système PCR ProFlex d'Applied Biosystems, appelé « ProFlex » dans cet article).

a Démonstration de différentes applications utilisant Epidax®, notamment : test de confirmation du SRAS-CoV-2 par RT-qPCR et dépistage par RT-PCR et RT-LAMP ; b Disposition pour RT–qPCR et test RT–PCR en point final utilisant une puce à 4 canaux avec un réactif RT–PCR singleplex et un échantillon d'extrait d'ARN ; et l'interprétation des résultats des tests. Un échantillon a été testé pour chaque puce en utilisant le FAM comme sonde de fluorescence. Canaux 1 et 2 pour NC et PC, respectivement ; canal 3 pour le gène N1 du SRAS-CoV-2 ; et le canal 4 pour le gène RP humain (IC). La couleur verte représente une détection positive tandis que la couleur grise représente une détection négative ; c Disposition pour les tests de RT–qPCR directe et de RT–PCR au point final utilisant une puce à 4 canaux avec un réactif de RT–PCR directe multiplex et un échantillon nasopharyngé en UTM. Deux échantillons (dans les canaux 2 et 3, respectivement) ont été testés dans chaque puce (démontrant la capacité d'Epidax® à tester plusieurs échantillons) ; canaux 1 et 4 pour CN et PC. Pour chaque canal, trois gènes cibles ont été détectés à l'aide de différentes sondes de fluorescence, notamment le gène E du SARS-CoV-2 (FAM), le gène N du SARS-CoV-2 (HEX) et la RNase P (Texas Red). Le gris représente un signal négatif et les autres couleurs (vert, vert clair et rouge) représentent un signal positif ; d Disposition pour RT-LAMP utilisant une puce à 6 canaux avec extrait d'ARN ; et l'interprétation des résultats. Deux échantillons ont été testés pour chaque puce. Canaux 1 et 2 pour NC et PC, respectivement. Les canaux 3, 4, 5 et 6 ont testé le gène N du SRAS-CoV-2 et le gène de la rActine humaine (IC) de deux échantillons différents, respectivement. La couleur jaune indique une détection positive et la couleur rose une réaction négative.

Des écouvillons nasopharyngés ont d'abord été prélevés sur des patients à des fins cliniques et testés par des hôpitaux locaux (National University Hospital et Ng Teng Fong General Hospital, Singapour); ce résultat d'essai est appelé "étalon de référence" dans cet article. Les échantillons restants ont été inactivés par la chaleur conformément aux directives nationales de biosécurité, puis envoyés à notre laboratoire pour être testés avec Epidax®. L'utilisation d'échantillons cliniques a été approuvée par le Domain Specific Review Board (DSRB 2020/00581 et 2020/00106) et le National University of Singapore Institutional Review Board (NUS-IRB-2020–666). Tous les échantillons négatifs en UTM ont été testés négatifs sur la plateforme Cobas 6800, qui est une plateforme échantillon-résultat. Tous les échantillons positifs (POS01 à POS28) ont été collectés en UTM, puis l'ARN viral a été extrait en utilisant l'extraction d'ADN et d'ARN viral abGenix sur un système d'extraction d'ADN et d'ARN viral abGenix (AITbiotect), suivie d'une RT-qPCR sur un système Bio-Rad. Les échantillons négatifs et positifs restants dans l'UTM ont été inactivés par la chaleur par les hôpitaux correspondants à 60 ° C pendant 30 min et 70 ° C pendant 30 min, respectivement, avant d'être transférés dans notre laboratoire. Pour nos tests sur Epidax®, l'ARN viral a d'abord été extrait de ces échantillons UTM restants inactivés à l'aide de Qiagen QIAamp® Viral RNA Mini (Cat No 52906) selon le protocole de spin du fabricant. Les échantillons d'ARN purifiés ont été divisés en aliquotes dans des tubes à usage unique et stockés dans un congélateur à -80 ° C pour des tests supplémentaires avec des réactifs RT – PCR ou des réactifs RT-LAMP.

Vingt des échantillons cliniques (ARN67 à ARN86) qui nous ont été transférés étaient des extraits d'ARN positifs, qui ont été extraits par la plateforme Qiagen EZ1 Advanced et suivis par RT-qPCR pour confirmer qu'ils étaient positifs pour le SRAS-CoV-2. La valeur seuil Ct utilisée par l'hôpital local était de 37. Ces extraits d'ARN positifs restants n'ont pas été inactivés par la chaleur avant d'être transférés à notre laboratoire. Ils ont été conservés dans un congélateur à -80 °C.

Selon l'application, un réactif RT-PCR, RT-PCR direct ou RT-LAMP a été ajouté à l'extrait d'ARN ou à l'échantillon UTM. Le mélange réactionnel a ensuite été chargé sur la puce microfluidique à l'aide d'une méthode de sandwich à l'huile (voir Fig. S3), et la puce a ensuite été montée sur le système pour l'amplification des acides nucléiques.

Pour tous les tests RT-PCR utilisant de l'ARN synthétique ou un extrait d'ARN clinique, le point final ou la surveillance en temps réel de l'émission de fluorescence pendant l'amplification a été effectué sur une puce à 4 canaux (voir Fig. 1e). Comme le montre la Fig. 2b, chaque puce a testé un échantillon (gène N1 du SRAS-CoV-2) et trois contrôles, un contrôle négatif (NC), un contrôle positif (PC) et un contrôle interne (IC - le gène humain de la RNase P). FAM a été utilisé comme sonde de fluorescence ; le vert représente un échantillon avec fluorescence (détection positive), tandis que le gris indique une fluorescence faible ou nulle (détection négative). Parallèlement, un ensemble séparé de mélanges réactionnels a été préparé et chargé sur le système Bio-Rad pour des tests de référence. À la fin de la réaction, les mélanges du système Bio-Rad ont été immédiatement chargés sur une puce vide propre pour être détectés avec le module de détection Epidax® en utilisant la méthode de sandwich à l'huile. Notez que pour chaque expérience, une image de la puce vide a d'abord été prise, et aucune fluorescence n'a été détectée.

Un réactif RT–PCR en une étape disponible dans le commerce (TaqPath™ 1-Step RT–qPCR Master Mix, Thermo Fisher Scientific) a été utilisé. Le protocole sur le système Bio-Rad comprend le chauffage de l'échantillon à 50 ° C et le maintien pendant 15 min, 92 ° C pendant 2 min, suivi de 45 cycles de 92 ° C pendant 3 s et 55 ° C pendant 30 s. Un protocole légèrement modifié a été utilisé sur Epidax® compte tenu de la précision du capteur de température : chauffage de l'échantillon à 51 °C pendant 15 min puis 92 °C pendant 2 min, suivi de 45 cycles de 92 °C pendant 5 s et 56 °C pendant 30 s (voir Fig. S4a). Des amorces pour les gènes N1 et RNase P humaine avec une sonde FAM (2019-nCov CDC EUA Kit, code produit 10006770 d'IDT) ont été utilisées (voir le tableau S1 pour les séquences). NC représente l'eau sans nucléase (HyPure™ Molecular Biology Grade Water, Nuclease free, HyClone™), tandis que PC représente le contrôle positif 2019-nCoV N à 10 000 copies par μL (IDT, code produit 1000 6625). Le mélange réactionnel de 10 µL contenait 0,75 µL d'amorce et de sonde, 2,5 µL de mélange maître RT-PCR, 4,25 µL d'eau sans nucléase et 2,5 µL de matrice d'ARN (voir tableau S2).

Pour la RT-PCR directe multiplex utilisant des échantillons nasopharyngés (Fig. 2c), deux échantillons ont été testés sur chaque puce à 4 canaux, démontrant la capacité de tester plusieurs échantillons avec notre plateforme. Pour chaque canal, trois gènes cibles ont été détectés par trois sondes de fluorescence, à savoir le gène E (FAM), le gène N (HEX) et la RNase P (Texas Red). Le test de benchmarking a été réalisé sur un système Bio-Rad. Le réactif commercial de RT-PCR directe utilisé était Resolute 2.0 (Advanced MedTech Holdings). Le profil de température sur le système Bio-Rad comprenait le chauffage de l'échantillon à 55 ° C et le maintien pendant 15 min, puis 92 ° C pendant 2 min, suivi de 45 cycles de 92 ° C pendant 3 s et 62 ° C pendant 30 s. Le protocole sur Epidax® consistait à chauffer l'échantillon à 56 °C et à le maintenir pendant 15 min, puis à 92 °C pendant 2 min, suivi de 45 cycles de 92 °C pendant 5 s et 63 °C pendant 30 s. Le mélange réactionnel contenait 9,65 µL de mélange réactionnel, 0,35 µL de mélange enzymatique et 2,5 µL d'échantillon (voir tableau S3). Le volume réactionnel total était de 12,5 µL.

Pour tous les tests RT-LAMP, une puce à six canaux (voir Fig. 1f) a été utilisée pour tester deux échantillons par puce. Aucun colorant fluorescent n'a été ajouté et le changement de couleur du mélange réactionnel a été détecté à l'œil nu. Les canaux 1 et 2 étaient respectivement pour NC et PC. Les canaux 3, 4, 5 et 6 ont testé le gène N du SRAS-CoV-2 et le gène de la rActine humaine (IC) de deux échantillons différents. Comme le montre la figure 2d, le jaune indique une détection positive et le rose indique une détection négative. Le test de benchmarking a été réalisé sur un système Proflex.

Un mélange d'amorces 10x a été préparé selon Zhang et al.31 : amorces d'amorces internes directes (FIP) et d'amorces internes arrière (BIP) de 16 µM (chacune), amorces F3 et B3 de 2 µM (chacune) et amorces de boucle avant (LF) et de boucle arrière (LB) de 4 µM (chacune). La RT-LAMP a été réalisée à l'aide d'amorces pour le gène NA et la rActine, comme indiqué dans le tableau S432, le mélange maître LAMP (WarmStart Colorimetric Lamp 2x Master Mix, NEB, #M1800L), de l'eau sans nucléase (HyPure™ Molecular Biology Grade Water, Nuclease free, HyClone™) et un contrôle positif 2019-nCoV N à 10 000 copies par μL (IDT, code produit 1 000 6625, concentration stock 200 000 copies par μL). Le mélange réactionnel contenait 2 µL de mélange d'amorces 10x, 10 µL de mélange maître LAMP, 5 µL d'eau sans nucléase et 3 µL de matrice d'ARN (voir Tableau S5). La réaction a été effectuée à 65 ° C pendant 30 minutes sur les systèmes Epidax® (voir Fig. S4b) et Proflex.

Des dilutions en série au 1/10 du contrôle d'ARN synthétique ultra-faible (contrôle positif AcroMetrix™ COVID-19, Cat No 954519, Thermo Fisher Scientific, concentration en stock de 100 copies par μL quantifiée à l'aide de Bio–Rad Droplet Digital™ PCR) ont d'abord été préparées dans de l'eau sans nucléase pour obtenir des concentrations de 100, 10 et 1 copies d'ARN par μL. Par la suite, 2,5 µL d'échantillon d'ARN à chaque concentration ont été mélangés avec 7,5 µL de mélange maître PCR et d'amorce N1 pour un volume de réaction de 10 µL (voir la disposition du test de sous-section pour la détection du SRAS-CoV-2 pour plus de détails). Quarante-cinq cycles de PCR ont été réalisés sur les systèmes Epidax® et Bio–Rad. Les images de fluorescence en temps réel à la fin de chaque cycle pour toutes les concentrations (100, 10, 1 et 0 copies d'ARN par μL) sont présentées dans le film S1. Les expériences ont été répétées cinq fois pour montrer la reproductibilité du système. Les figures 3a, b comparent les valeurs de Ct pour chaque concentration obtenues à partir d'Epidax® et de Bio–Rad. Les figures 3c, d montrent les tracés d'amplification d'un cycle traité par Epidax® et Bio-Rad, respectivement, tandis que la figure 3e compare les images de fluorescence des échantillons après 45 cycles. Sur les systèmes Epidax® et Bio–Rad, 4 réplicats sur 5 ont donné une amplification pour 1 copie par µL d'ARN SARS-CoV-2 synthétique. Ceci illustre qu'Epidax® fonctionne aussi bien que Bio–Rad à l'amplification de 1 copie d'ARN par µL. La limite de détection (LOD) de ce test utilisant à la fois les systèmes Epidax® et Bio–Rad pour la qPCR et la PCR au point final était de 10 copies par μL (ou 25 copies par réaction, avec un volume de réaction de 10 μL), car les 5 réplicats ont montré une amplification positive. La LOD est définie ici comme la concentration la plus faible détectable, avec 95 % des échantillons (vrais positifs) montrant une détection positive.

a Valeurs RT–PCR Ct qui ont été traitées avec Epidax®. b Valeurs RT–PCR Ct qui ont été traitées avec le système Bio–Rad. c Tracé d'amplification d'un run avec Epidax®. d Tracé d'amplification d'une analyse à l'aide du système Bio–Rad. e Images de fluorescence des échantillons après 45 cycles de PCR (Cycle 45) sur les systèmes Epidax® et Bio–Rad ; f Images colorimétriques des échantillons après réaction RT-LAMP sur les systèmes Epidax® et Proflex.

Dans les tests analytiques RT-LAMP, des dilutions en série de 2 fois d'ARN synthétique portant le gène N du SRAS-CoV-2 (VR-3276SD, ATCC) ont été préparées dans de l'eau sans nucléase pour atteindre des concentrations de 800, 400, 200, 100 et 50 copies d'ARN par μL. Par la suite, 3 µL d'échantillon d'ARN à chaque concentration ont été mélangés avec 17 µL de mélange maître RT-LAMP et d'amorces pour une réaction de 20 µL (reportez-vous à la disposition du test de sous-section pour la détection du SRAS-CoV-2 pour plus de détails). L'amplification isotherme a été réalisée sur les systèmes Epidax® et Proflex pendant 30 min à 65 °C. Les expériences ont été répétées cinq fois pour montrer la reproductibilité du système. Comme le montrent les Fig. 3f, 4 répétitions sur 5 ont donné une amplification (c'est-à-dire une couleur jaune) pour 100 copies par μL d'ARN SARS-CoV-2 synthétique sur les deux systèmes. La LOD de ce test RT-LAMP était de 200 copies par μL. Cela montre qu'Epidax® est aussi bon que Proflex.

a Valeurs Ct de 23 échantillons positifs détectés par Epidax® ; b Valeurs Ct de 23 échantillons positifs détectés par Bio–Rad ; c Valeurs Ct de 20 échantillons négatifs détectés par Epidax® ; d Valeurs Ct de 20 échantillons négatifs détectés par Bio–Rad. Les valeurs Ct qui n'ont pas été détectées sont tracées comme 46 à des fins de visualisation. La ligne pointillée représente la ligne de coupure (valeur Ct de 37) utilisée par les hôpitaux locaux, c'est-à-dire qu'une valeur Ct inférieure à 37 est considérée comme un échantillon positif alors qu'elle est négative dans le cas contraire. Tous les contrôles, y compris NC, PC et IC de tous les échantillons, ont été effectués comme prévu.

Pour le test de spécificité analytique, veuillez vous reporter à l'annexe B, tableaux S6 à S8 dans les informations supplémentaires.

Dans cette section, nous avons démontré l'utilisation d'Epidax® pour la détection du SARS-CoV-2 avec RT–qPCR pour 43 échantillons cliniques (23 positifs connus et 20 négatifs connus). Pour chaque échantillon clinique, 2,5 μL d'extrait d'ARN purifié ont été mélangés à 7,5 μL de mélange maître RT-PCR singleplex (se reporter à la disposition du test de sous-section pour la détection du SRAS-CoV-2 pour la préparation du mélange réactionnel). Quarante-cinq cycles ont été exécutés avec chaque canal chargé avec 10 μL du mélange réactionnel (voir Fig. 2b pour la disposition du test et l'interprétation des résultats).

Des images de fluorescence en temps réel à la fin de chaque cycle ont été capturées et analysées à l'aide de notre système (voir les films S2 et S3 pour un échantillon négatif et positif, respectivement). Les valeurs Ct des trois témoins et des échantillons traités avec Epidax® étaient similaires à celles traitées avec le système Bio-Rad (voir Fig. 4 - Les valeurs Ct qui n'ont pas été détectées sont représentées par 46 à des fins de visualisation).

L'application d'une valeur Ct seuil de 37, qui a été utilisée par les hôpitaux locaux, a montré que tous les contrôles fonctionnaient comme prévu. Parmi les échantillons (canal 3), tous les échantillons positifs connus et les échantillons négatifs connus ont été correctement identifiés à l'aide des systèmes Epidax® et Bio-Rad, montrant une plage de Ct de 14,7 à 37 pour les échantillons positifs (Fig. 4a, b) ; et 46 (c'est-à-dire non détecté) pour les échantillons négatifs (voir Fig. 4c, d). Par conséquent, nous rapportons des performances comparables d'Epidax® avec le système Bio-Rad dans un test de confirmation du SRAS-CoV-2 en utilisant la voie RT-qPCR.

Nous avons effectué un test RT-PCR en point final avec Epidax® sur 81 échantillons cliniques (40 positifs pour le SRAS-CoV-2 et 41 négatifs connus). Ici, le module de détection a été attaché uniquement pour capturer des images de fluorescence de la puce au cycle 0 (avant la réaction) et au cycle 45 (à la fin du cycle thermique - voir Fig. S5). Le dépistage du SRAS-CoV-2 a été effectué par seuillage d'intensité dans lequel un échantillon était considéré comme positif si l'intensité relative était supérieure au seuil de dépistage de 10 et négatif dans le cas contraire. Les 40 échantillons positifs connus et les 41 échantillons négatifs connus ont été correctement identifiés comme positifs et négatifs, respectivement, par les systèmes Epidax® et Bio-Rad (Fig. 5). Ainsi, la sensibilité et la spécificité de notre test pour le SRAS-CoV-2 étaient de 100 %, avec des taux de faux négatifs et de faux positifs de 0 %. La sensibilité est ici définie comme les vrais positifs/(vrais positifs + faux négatifs), et la spécificité est définie comme les vrais négatifs/(vrais négatifs + faux positifs)33. La figure S6 trace les intensités relatives obtenues pour chaque canal séparément. Il est clair que les signaux obtenus avec Epidax® sont comparables à ceux de Bio-Rad.

a Détecté par Epidax® ; b Obtenu en exécutant 45 cycles de PCR sur le système Bio-Rad, puis les échantillons ont été chargés sur une puce vide et les images de fluorescence capturées à l'aide du module de détection Epidax® et les images analysées de la même manière que celle d'Epidax®. En utilisant le même seuil d'intensité relative 10 (ligne pointillée), 40 échantillons positifs (avec des intensités relatives comprises entre 20 et 42) et 41 échantillons négatifs (tous avec des intensités relatives inférieures à 10) ont été détectés avec précision. Tous les contrôles ont fonctionné comme prévu : tous les NC avaient des intensités relatives inférieures à 10, tandis que tous les PC et CI avaient des intensités relatives supérieures à 10 (dans la plage de 20 à 44).

Généralement, pour le dépistage du COVID-19 chez les patients, Epidax® est aussi bon que le Bio-Rad.

Pour étudier la durée du test RT-PCR au point final, les intensités de fluorescence de 23 échantillons positifs et de 20 échantillons négatifs (utilisés dans le test RT-qPCR de la Fig. 4) ont été mesurées à la fin des cycles 37, 40 et 45. La Fig. S7 trace les intensités relatives de trois contrôles et échantillons aux cycles 37, 40 et 45. Test PCR. À la fin du cycle 37, les intensités de certains échantillons et CI positifs étaient toujours inférieures au seuil de dépistage. À la fin du cycle 40, il n'y avait qu'un seul faux négatif et les 42 autres échantillons étaient tous correctement identifiés. La meilleure performance a été obtenue au cycle 45, où tous les échantillons ont été correctement identifiés comme positifs et négatifs.

Des économies importantes de temps et d'argent pourraient être réalisées avec des protocoles de RT-PCR directs dans lesquels l'extraction d'ARN n'est pas nécessaire. Ici, nous démontrons la détection rapide échantillon-réponse du SRAS-CoV-2 à l'aide de notre plate-forme avec un kit de RT-PCR directe multiplex sur des échantillons d'écouvillonnage nasopharyngé (voir Fig. 2c pour la disposition du test et la disposition du test de sous-section pour la détection du SRAS-CoV-2 pour la préparation du mélange réactionnel). Nous avons effectué des tests RT-PCR directs en temps réel et en point final sur 44 échantillons cliniques en UTM (24 positifs connus et 20 négatifs connus). Deux échantillons ont été testés sur chaque puce, et la durée du test de l'échantillon au résultat était d'environ une heure.

Pour le dépistage du SARS-CoV-2, notre plateforme a correctement identifié 23/24 échantillons positifs et 19/20 échantillons négatifs, tandis que Bio–Rad a détecté avec précision 24/24 positifs et 17/20 négatifs (voir Fig. S8 et Tableau S9 pour des résultats détaillés). Les échantillons qui n'ont pas été correctement identifiés avaient des valeurs Ct d'environ 37, qui était la valeur seuil utilisée par les hôpitaux locaux.

Pour la détection en temps réel, nous avons collecté uniquement des images de fluorescence (pour la détermination de la valeur Ct) du gène N du SRAS-CoV-2 (HEX), comme indiqué dans le tableau S10. Notre système a détecté 23/24 positifs et 20/20 négatifs, tandis que Bio-Rad a détecté 24/24 échantillons positifs et 18/20 échantillons négatifs.

Epidax® a été utilisé pour analyser 54 extraits d'ARN cliniques (30 positifs connus, 24 négatifs connus) à l'aide de RT-LAMP. Les échantillons avec les réactifs RT-LAMP et les ensembles d'amorces ciblant le gène N du SARS-CoV-2 ont été chargés sur la puce pour Epidax® et dans des tubes pour le système Proflex (voir Fig. 2d pour la disposition du test). Deux échantillons ont été testés ensemble dans chaque cycle (voir Fig. S9 pour les résultats des tests). Généralement, le changement de couleur sur la puce était comparable aux résultats obtenus avec le système Proflex. Nous avons observé que ce test RT-LAMP détectait de manière fiable des échantillons positifs avec des valeurs de Ct RT-qPCR allant jusqu'à 30, ce qui est en bon accord avec les résultats de l'étude de Dao Thi et al.34. Cependant, pour les échantillons positifs avec des valeurs Ct supérieures à 30, nous rapportons 12 échantillons sur 16 avec des résultats faussement négatifs.

L'étalon-or actuel pour la détection du SRAS-COV-2 à partir d'écouvillons nasopharyngés est basé sur la RT-qPCR, qui nécessite des protocoles de laboratoire pour l'extraction virale. La plupart des tests de diagnostic COVID-19 commerciaux sont destinés à être utilisés en laboratoire sur des appareils à grande empreinte et à coûts élevés et ne sont pas adaptés aux paramètres POC35. Bien qu'ils soient automatisés et à haut débit, ils ne conviennent pas au déploiement sur site à des fins de dépistage. Les systèmes POC nécessitent souvent un prix abordable, une portabilité et la capacité de fonctionner dans des environnements à faibles ressources.

Ici, nous avons démontré une plate-forme modulaire avec flexibilité pour de multiples applications avec une large gamme de sensibilité (voir le tableau 1 et le tableau S11 pour la comparaison des dispositifs POC pour la détection des acides nucléiques du SRAS-CoV-2). Cet appareil POC peut être utilisé à la fois pour le dépistage du SRAS-CoV-2 et les tests de confirmation. Notre système a identifié avec précision 40 extraits d'ARN positifs et 41 négatifs à l'aide de la PCR en point final (pour le dépistage du SRAS-CoV-2) et 23 extraits d'ARN positifs et 20 négatifs à l'aide de la PCR en temps réel (pour le test de confirmation du SRAS-CoV-2), démontrant un accord complet avec une plateforme commerciale (système Bio-Rad), avec une sensibilité de 100 % et une spécificité de 100 %. Pour permettre des économies de temps et d'argent qui ont contribué à l'expansion des tests, nous avons utilisé un kit de RT-PCR directe sans extraction d'ARN pour détecter correctement 23 échantillons nasopharyngés positifs et 19 négatifs à l'aide de la PCR en point final et 23 échantillons nasopharyngés positifs et 20 négatifs à l'aide de la PCR en temps réel montrant une spécificité de 95 % et une sensibilité de 96 %. Le système peut également fonctionner comme un test colorimétrique RT-LAMP, identifié 30 extraits d'ARN positifs et 24 négatifs avec une spécificité de 100 % et détecté avec précision 14/14 échantillons positifs avec des valeurs Ct inférieures à 30 (notez que nous ne calculons pas la sensibilité globale du test RT-LAMP ici en raison de la propagation limitée des valeurs Ct des échantillons positifs disponibles - comme le montrent les Fig. 4a, b, il existe deux groupes distincts de valeurs Ct).

Cette plateforme POC a démontré une LOD de 10 copies par μL (ou 25 copies par réaction avec un volume de réaction de 10 µL) avec de l'ARN synthétique pour la RT-PCR et 200 copies par μL de LOD pour la RT-LAMP. Des études sur la charge virale du SARS-CoV-2 dans des échantillons cliniques indiquent que cette limite de détection correspond aux besoins cliniques36,37.

À l'aide de cette plateforme, nous avons établi à la fois des tests de dépistage et de confirmation pour le SRAS-CoV-2. La RT-PCR ou la RT-LAMP peuvent être réalisées aux profils de température souhaités, et le signal peut être détecté soit par un signal de fluorescence, soit par un changement de couleur. Comme démontré, le système a une grande configurabilité qui lui permet d'exécuter une variété de protocoles d'amplification d'acide nucléique (RT-PCR, RT-LAMP, etc.) sur différents types d'échantillons (extraits d'ARN, écouvillons nasopharyngés en UTM, etc.). Il peut également être étendu pour exécuter d'autres protocoles (tels que l'amplification par recombinase polymérase et la RT-LAMP34,38,39,40,41 directe) sur d'autres types d'échantillons, tels que la salive42,43,44, avec des modifications minimes de la conception de la puce.

Pour augmenter le débit de test, la puce peut être étendue pour avoir plus de microcanaux pour traiter simultanément des échantillons supplémentaires. Le temps de traitement de l'échantillon à la réponse sur notre système est d'une heure pour la RT-PCR directe et pourrait être encore réduit en optimisant le protocole PCR. Notre système est compact et déployable dans un environnement POC aux points d'entrée, cliniques de terrain ou communautaires, écoles, maisons de retraite, lieux de travail, etc. De plus, l'unité thermique et le module de détection peuvent permettre d'étendre les tests. Par exemple, nous pouvons effectuer plusieurs tests RT-PCR ou RT-LAMP en parallèle, et la lecture des résultats peut être effectuée à l'aide du module de détection. Ce module de détection peut facilement fonctionner comme une unité autonome pour la détection et l'analyse basées sur l'image. Cela contraste avec le système qPCR de laboratoire traditionnel, qui intègre des unités thermiques et de détection et doit fonctionner comme une seule unité.

Pris ensemble, le système offre une plate-forme de détection modulaire, rentable, compacte et portable pour les diagnostics au point de service dans les environnements cliniques et sur le terrain. Cette plate-forme de diagnostic fournit une suite de fonctionnalités qui réduit les contraintes et la complexité d'une installation en laboratoire et assure un plus grand succès dans la conception d'une stratégie de test plus efficace pour la communauté.

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Nous remercions le Dr Chun Ping Lim pour sa discussion fructueuse et ses conseils sur le package d'analyse. Cette recherche est financée par l'Université nationale de Singapour (NUS), numéro de référence de subvention NUSCOVID19RG-34. Nous reconnaissons également le soutien fourni par l'Institute for Health Innovation and Technology (iHealthtech) de NUS.

Institute for Health Innovation and Technology (iHealthtech), Université nationale de Singapour, MD6, 14 Medical Drive #14-01, Singapour, 117599, Singapour

Phuong Quoc Mai Nguyen, Ming Wang, Nelisha Ann Maria, Adelicia Yongling Li, Hsih Yin Tan, Gordon Minru Xiong, Ali Asgar S. Bhagat, Catherine WM Ong et Chwee Teck Lim

Département de génie biomédical, Université nationale de Singapour, 4 Engineering Drive 3, Block 4, #04-08, Singapour, 117583, Singapour

Phuong Quoc Mai Nguyen, Ali Asgar S. Bhagat et Chwee Teck Lim

Advanced MedTech, 2 Venture Drive, #23-18 Vision Exchange, Singapour, 608526, Singapour

Meng-KwangMarcus Tan

Programme de recherche translationnelle sur les maladies infectieuses, Département de médecine, École de médecine Yong Loo Lin, Université nationale de Singapour, NUHS Tower Block, 1E Kent Ridge Road Level 11, Singapour, 119228, Singapour

Catherine WM Ong

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CTL a initié et dirigé le projet. PQMN a développé le module de température sur puce et conçu et fabriqué les puces microfluidiques. MW a développé le matériel pour le système de détection et le code pour l'acquisition d'images en temps réel. PQMN a développé le logiciel d'analyse d'images pour le dépistage du SRAS-CoV-2 en temps réel et en point final et a analysé les données. PQMN, NAM et AYL ont effectué des tests sur des échantillons synthétiques et cliniques. HYT a effectué une extraction d'ARN sur des échantillons cliniques. GMX a effectué une analyse in silico des amorces. La CWMO a supervisé la collecte d'échantillons cliniques avec les approbations éthiques et bioréglementaires requises. Le CNAC et GMX ont participé aux discussions sur le projet. MKMT a fourni des réactifs RT-PCR directs pour la détection du SRAS-CoV-2. PQMN a rédigé le manuscrit. Tous les auteurs ont édité le manuscrit.

Correspondance à Catherine WM Ong ou Chwee Teck Lim.

CTL, PQMN, MW, AYL, GMX et AASB, ainsi que d'autres, ont déposé une demande de brevet sur la technologie décrite ici.

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Réimpressions et autorisations

Nguyen, PQM, Wang, M., Ann Maria, N. et al. Système modulaire de micro-PCR pour le diagnostic rapide sur site du COVID-19. Microsyst Nanoeng 8, 82 (2022). https://doi.org/10.1038/s41378-022-00400-3

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Reçu : 19 février 2022

Révisé : 17 avril 2022

Accepté : 05 mai 2022

Publié: 19 juillet 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41378-022-00400-3

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