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The ISME Journal (2023)Citer cet article

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L'analyse multi-omique est un outil puissant pour la détection et l'étude des interactions inter-royaumes, telles que celles entre les membres bactériens et archéens des communautés microbiennes complexes productrices de biogaz. Dans la présente étude, les microbiomes de trois digesteurs de biogaz à l'échelle industrielle, chacun alimenté avec différents substrats, ont été analysés à l'aide d'un cadre de métagénomique centré sur l'apprentissage automatique complété par des données de métatranscriptome. Ces données nous ont permis d'élucider la relation entre les communautés méthanogènes centrales abondantes et leurs partenaires bactériens syntrophes. Au total, nous avons détecté 297 génomes assemblés par métagénomes non redondants (nrMAGs) de haute qualité. De plus, les profils de gènes d'ARNr 16 S assemblés de ces nrMAG ont montré que le phylum Firmicutes possédait le nombre de copies le plus élevé, tandis que les représentants du domaine archéen avaient le plus bas. Une enquête plus approfondie des trois communautés microbiennes anaérobies a montré des altérations caractéristiques au fil du temps, mais est restée spécifique à chaque usine de biogaz à l'échelle industrielle. L'abondance relative de divers micro-organismes telle que révélée par les données du métagénome était indépendante des données correspondantes sur l'activité du métatranscriptome. Les archées ont montré une activité considérablement plus élevée que ce à quoi on s'attendait en raison de leur abondance. Nous avons détecté 51 nrMAG qui étaient présents dans les trois microbiomes d'usine de biogaz avec des abondances différentes. Le microbiome central était en corrélation avec les principaux paramètres de fermentation chimique, et aucun paramètre individuel n'a émergé comme facteur prédominant de la composition de la communauté. Divers mécanismes de transfert interspécifiques H2/électrons ont été attribués aux méthanogènes hydrogénotrophes dans les usines de biogaz fonctionnant à la biomasse agricole et aux eaux usées. L'analyse des données du métatranscriptome a révélé que les voies de méthanogenèse étaient les plus actives de toutes les principales voies métaboliques.

Dans les systèmes de digestion anaérobie (DA) artificiels, la décomposition de la matière organique et la production de biogaz reposent sur un recyclage efficace des nutriments [1, 2]. Ce processus implique une communauté microbienne diversifiée, chaque microbe ayant un rôle spécifique. La composition et la fonction de la communauté microbienne impliquée dans les étapes de la MA jouent un rôle important dans l'efficacité du processus global, qui est également influencé par de nombreux facteurs, tels que les interactions microbe-microbe, la composition du substrat, les paramètres physicochimiques et les conditions opératoires [3,4,5,6].

Démêler les interactions microbiennes et leurs mécanismes sous-jacents est une tâche complexe car de nombreux microbes ne peuvent pas survivre sans partenaires microbiens spécifiques [7]. Des méthodes innovantes d'isolement et de culture microbienne ont été développées, certaines se sont avérées efficaces pour amener de nouveaux micro-organismes en culture [8]. Cependant, le développement et l'avancement de ces technologies sont nécessaires pour libérer tout le potentiel de la diversité microbienne [9, 10]. Puisqu'il existe de fortes interactions syntrophiques entre les microbes dans les consortiums microbiens AD, des recherches approfondies sont nécessaires pour comprendre leur diversité, leur rôle métabolique et leur distribution. Ces études ont été initialement entravées par les limitations inhérentes aux méthodes microbiologiques dépendantes de la culture, qui nécessitent l'isolement des micro-organismes et peuvent être difficiles lorsque les relations syntrophiques sont omniprésentes [11,12,13]. Le séquençage à haut débit et les outils bioinformatiques permettent une analyse en masse du matériel génomique et donnent ainsi un aperçu de la taxonomie et des fonctions de communautés microbiennes entières [14,15,16].

L'identification et la caractérisation du génome des microbes couramment trouvés dans les microbiomes de la MA peuvent révéler des voies cruciales et des caractéristiques écologiques impliquées dans la chaîne alimentaire microbienne [17, 18]. Des études antérieures utilisant le séquençage des amplicons du gène ARNr 16 S ont montré que les micro-organismes centraux créent une communauté stable capable de résister à diverses perturbations (c'est-à-dire aux changements de paramètres AD) [19,20,21]. Cependant, le séquençage des amplicons et les approches métagénomiques basées sur la lecture peuvent être incapables d'identifier des espèces inconnues par analyse du microbiome de base en raison de leur dépendance aux bases de données de référence [22, 23]. De plus, les communautés productrices de biogaz représentent un contingent important et diversifié de micro-organismes non caractérisés qui ont été précédemment décrits comme une "matière noire microbienne" [19, 24, 25]. Pour résoudre ce problème, des algorithmes bioinformatiques de plus en plus sophistiqués peuvent être utilisés pour reconstruire les génomes d'espèces individuelles (ou MAG : génomes assemblés par métagénome) à partir de ces communautés complexes [26,27,28].

Plusieurs études récentes utilisant la métagénomique résolue par le génome ont récupéré des MAG caractéristiques à partir de réacteurs de biogaz à l'échelle de laboratoire et industrielle [23, 29,30,31]. Ces études ont révélé que les Bacteroides et les Firmicutes ont des interactions polyvalentes avec les méthanogènes hydrogénotrophes grâce à leurs capacités de production de H2, de CO2 et de formiate [17, 32]. De plus, la concentration en ammoniac est le principal paramètre façonnant la communauté méthanogène [29]. Il est nécessaire de reconstruire des fragments de génome à partir du métagénome de manière efficace et précise pour explorer ces interactions in silico [33, 34]. Des études récemment publiées ont démontré que l'apprentissage automatique semi-supervisé pouvait améliorer considérablement les performances de binning [35, 36], ce qui, combiné à une approche métatranscriptomique, peut permettre un examen plus approfondi des interactions microbiennes dans différents environnements.

La présente étude a étudié la structure et la fonction des microbiomes dans trois réacteurs de biogaz de taille industrielle, chacun alimenté avec un substrat distinct et caractéristique. Chaque réacteur a été surveillé à des intervalles saisonniers sur une période d'un an. Le séquençage Shotgun suivi d'un cadre d'analyse métagénomique et métatranscriptomique centré sur l'apprentissage automatique a été utilisé pour identifier la composition microbienne et les activités métaboliques en cours. La partie partagée de la communauté microbienne impliquée dans la digestion de substrats hétérogènes a été étudiée à l'aide d'un concept de communauté centrale basé sur l'occurrence [37]. L'objectif principal de cette recherche était de découvrir la relation entre l'abondante population méthanogène de base et des bactéries syntrophiques particulières. Plus précisément, nous nous concentrons sur les réseaux clés de la syntrophie interspécifique et trouvons une corrélation intrigante entre les paramètres de fermentation chimique et le microbiote anaérobie central présent dans les réacteurs.

Des échantillons ont été prélevés dans trois digesteurs anaérobies de pointe en Hongrie. Deux des digesteurs se trouvent à Szeged (MWBP et SZBP) et l'autre à Kecskemét (KBP). Les principales caractéristiques de chaque installation de biogaz étudiée ici sont résumées dans le Suppl. Tableau 1. Ces usines de biogaz ont été sélectionnées selon les critères suivants : (i) les digesteurs fonctionnent sans problème depuis plus de cinq ans ; et (ii) les digesteurs utilisent des biopolymères distincts comme principal substrat de décomposition pour la production de biogaz. L'échantillonnage a été effectué pendant une période d'un an aux intervalles (saisonniers) suivants : octobre 2020, janvier 2021, avril 2021 et juillet 2021. Les échantillons ont été directement transportés au laboratoire et ont été traités immédiatement à leur arrivée. Les mesures des paramètres AD et la purification de l'ADN/ARN ont été effectuées sur des échantillons frais d'usine de biogaz (BP) en trois exemplaires (c'est-à-dire, trois exemplaires biologiques : n = 3).

Pour chaque BP, nous avons mesuré : le pH des boues, le rapport carbone sur azote (C/N), la teneur en solides totaux (TS), la teneur en solides volatils (VS), l'azote ammoniacal total (TAN ; c'est-à-dire les ions ammonium et l'ammoniac dissous), la teneur en acides organiques volatils (VOA) et le carbone inorganique total (TIC). Les mesures ont été prises comme précédemment publié [38].

Des tests par lots de potentiel biochimique de méthane (BMP) ont été effectués dans des réacteurs de 160 ml (bouteille de sérum en verre Wheaton, Z114014 Sigma-Aldrich) contenant 60 ml de phase liquide. Le rapport inoculum (teneur en PB filtrée pour éliminer les particules de plus de 2 mm) sur substrat (α-cellulose : C8002 Sigma-Aldrich) a été fixé selon la norme VDI 4630 (Vereins Deutscher Ingenieure 4630, 2006) au rapport inoculum sur substrat VS = 2:1. Une description détaillée des procédures d'échantillonnage et de mesure des gaz peut être trouvée dans une publication précédente [39].

Des aliquotes de 2 ml ont été obtenues à partir des échantillons de chaque BP pour l'isolement total de l'ADN et de l'ARN de la communauté. La purification a été effectuée en triple exemplaire et les extractions résultantes ont été regroupées. Toutes les extractions ont été réalisées à l'aide des kits de miniprep ADN/ARN ZymoBIOMICS (R2002, Zymo Research, Irvine, USA). Après la lyse (l'homogénéisation des billes a été réalisée à l'aide d'un Vortex Genie 2 avec une taille de billes de 0,1 mm, un temps d'homogénéisation de 15 min et à vitesse maximale), le protocole de purification parallèle de l'ADN et de l'ARN du kit Zymo Research a été suivi. Les quantités d'ADN et d'ARN ont été estimées à l'aide d'une Agilent 2200 TapeStation (Agilent Technologies, Santa Clara, USA).

Nous avons suivi de près toutes les recommandations du fabricant pour la plate-forme de séquençage Illumina (Illumina Inc., San Diego, États-Unis). Des échantillons d'ADN génomique regroupés ont été utilisés pour séquencer des bibliothèques construites à l'aide du kit de préparation de bibliothèque NEBNext Ultra II (NEB, Ipswich, États-Unis). Le séquençage métagénomique apparié a été réalisé sur un séquenceur NextSeq 550 (Illumina) à l'aide du kit de réactifs de séquençage NextSeq High Output Kit v2. Le séquençage du métatranscriptome à partir d'échantillons d'ARN regroupés a été effectué comme suit : les bibliothèques ont d'abord été préparées à l'aide d'un kit de bibliothèque d'ARN total Zymo-Seq RiboFree, qui comprend une étape de déplétion universelle de l'ARNr. Le séquençage de l'ARNm à extrémité appariée a ensuite été effectué sur un séquenceur NextSeq 550 (Illumina) à l'aide du kit de réactifs de séquençage NextSeq High Output Kit v2. L'analyse des données primaires (c'est-à-dire l'appel de base) a été effectuée à l'aide du logiciel "bcl2fastq" (version 2.17.1.14, Illumina). Les paramètres des fragments caractéristiques sont résumés dans le tableau supplémentaire 2.

Les séquences brutes ont été filtrées par fastp (version 0.23.2, longueur requise : 150 bp) et vérifiées avec FastQC (version 0.11.8). Les séquences filtrées produites par fastp ont ensuite été co-assemblées séparément par Megahit (version 1.2.9, 4 échantillons par BP = 3 co-assemblages). Les paramètres utilisés étaient les suivants : min contig length = 1500 ; taille min k-mer = 21 ; taille max k-mer = 141 [40]. La procédure de binning métagénomique a été effectuée séparément pour chaque ensemble de données métagénomique AD jusqu'à l'étape de déréplication. Nous avons utilisé Anvi'o (version 7 : "hope") pour créer la base de données contig pour le flux de travail métagénomique suivant [41].

La reconstruction du génome a été réalisée à l'aide de Semibin (version 1.1.1), un progiciel guidé par l'apprentissage automatique qui combine une approche semi-supervisée avec des réseaux de neurones siamois profonds en utilisant un flux de travail de co-assemblage avancé avec un mode semi-supervisé [35]. Pour la déréplication et la filtration de qualité des génomes assemblés par métagénome (MAG), nous avons utilisé dRep (version 2.2.3) et CheckM2 (version 1.0.1) avec les paramètres suivants : dérépliquer : comp 10, con 5, S_algorithm fastANI, sa 0,95, et prédire la fonction en cas de CheckM2 [42, 43]. Il convient de noter que dRep utilise CheckM1, de sorte que la contamination des nrMAGs peut différer des paramètres de filtrage dRep (tableau supplémentaire 3). MarkerMAG a été utilisé en mode par défaut pour détecter, assembler et lier les gènes d'ARNr 16 S aux MAG et calculer le nombre de copies correspondant (matam_16s : pct 5,10,25,50,75,100 -i 0,99, et fonction de liaison sur les paramètres par défaut) [44].

Les cadres de lecture ouverts (ORF) ont été identifiés par Prodigal (version 2.6.3). La version 5.31–70 d'InterProScan a été utilisée pour annoter fonctionnellement les séquences codant les gènes à l'aide de la base de données Pfam [45]. Les profils fonctionnels ont été complétés à l'aide des données des modules fonctionnels de l'Encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto (KEGG) par Anvi'o (anvi-run-kegg-kofams) [46]. Les enzymes impliquées dans l'utilisation des glucides ont été identifiées à l'aide d'une combinaison de profils fonctionnels Pfam et de données de la base de données des enzymes actives sur les glucides (CAZy) [47]. Nous avons ensuite utilisé la base de données taxonomique du génome (GTDB : version 207) avec GTDB-Tk (version 2.1.1) pour l'attribution taxonomique [48]. Les MAG non redondants reconstruits (nrMAG) qui montraient une complétude supérieure à 90 % ont également été comparés aux entrées de la base de données Biogas Microbiome [29] à l'aide de fastANI (version 1.33) [49]. Les statistiques nrMAG sont résumées dans le tableau supplémentaire 3.

Les valeurs d'abondance des nrMAGs dans chaque échantillon ont été calculées avec le module quant_bin MetaWRAP (version : 1.3.2) (en utilisant Salmon), similaire au processus de calcul TPM (transcription par million), qui fait ici référence aux "copies par million de lectures" (CPM ; tableau supplémentaire 4) [50]. Les lectures sont alignées sur les contigs de nrMAG, et les valeurs de couverture résultantes ont été normalisées par taille d'échantillon (pour chaque million de lectures métagénomiques) et par longueur de contig (en nucléotides). Des arbres phylogénomiques ont été générés à l'aide d'un ensemble de 120 gènes bactériens et 53 gènes archéens à copie unique (SCG) via GTDB-Tk (version 2.1.1 ; classify_wf) et IQTree2 (version 2.2.0.3) en utilisant les paramètres suivants : nombre de bootstraps : 1000 ; itération maximale : 1 000 ; règle d'arrêt : 100 [51, 52]. L'outil interactif Tree of Life (iTOL : version 6.7.3 ; https://itol.embl.de/) a été utilisé pour visualiser l'arbre phylogénomique ainsi que certains résultats de binning.

Nous avons d'abord extrait les ORF des MAG à l'aide de bedtools : getfasta (version : 2.27.1) pour obtenir des appels de gènes spécifiques à MAG. Nous les avons ensuite combinés pour créer un index Salmon (en utilisant le paramètre keepDuplicates ; https://github.com/COMBINE-lab/salmon). Le nombre de lectures a été calculé avec Salmon (version 1.8.0) en mode quasi-cartographie avec correction du biais GC (gcBias). Le fichier de sortie principal (quants.sf) contient le nombre quantifié de lectures (numReads) et sa quantité en valeurs TPM (tableau supplémentaire 5). Le processus de calcul du TPM (utilisé comme mesure d'activité dans la présente étude) a été effectué de la même manière que mentionné précédemment, en prenant le gène efficace pondéré en fonction de la longueur (biais GC) et les lectures transcriptomiques cartographiées par corrections d'échantillon.

Les résultats des tests BMP ont été visualisés par ggplot2 (version 4.1.3) et les différences significatives entre les potentiels de biogaz maximaux (c'est-à-dire à partir de tests par lots utilisant de l'α-cellulose) ont été calculées à l'aide du package ggsignif (version 0.6.4) (c'est-à-dire en utilisant un test de Wilcoxon entre paires, avec des ANOVA unidirectionnelles utilisées pour comparer plusieurs groupes) [53]. La mise à l'échelle multidimensionnelle des échantillons (c'est-à-dire les tracés MDS pour afficher les dissemblances de Bray-Curtis), l'abondance de MAG et les valeurs d'activité ont été visualisées par microViz (version 0.9.0) [54]. Les distances euclédiennes et les différences entre les échantillons ont été calculées (à l'aide d'une analyse de variance permutationnelle multivariée ; PERMANOVA : n_perms : 1 000) et visualisées par le package microeco R (version 0.14.1) [55]. To assess the significance of differences between MAGs, we used lefser (the R package for linear discriminant analysis effect size calculator; version 4.3) inside microeco, with a significance threshold of p ≤ 0.05 (trans_diff: alpha = 0.05, p_adjust_method = fdr, lefse_min_subsam = 10, lefse_norm = 1e + 06, boots = 30) [56].

Nous avons ensuite analysé les données d'occurrence pour identifier le microbiome central. Un taxon observé dans 83,3 % des échantillons (c'est-à-dire dans 10 échantillons sur 12) avec une abondance supérieure à 1 (couverture génomique ~10x) a été considéré comme un membre du microbiome central [37]. Les packages ggvenn et ggtern (versions 0.1.10 et 3.4.1) ont été utilisés pour visualiser la distribution du microbiome central (au niveau de l'espèce et du phylum) entre les BP [53]. L'analyse de cooccurrence et les corrélations entre les paramètres AD et les identifiants taxonomiques des principaux membres du microbiome (au niveau de l'espèce ou autrement au niveau taxonomique le plus élevé) ont été calculées par microeco [55]. NetComi (construction et comparaison de réseaux pour les données du microbiome ; version 1.1.0) a été utilisé pour calculer et normaliser la matrice d'association (trans_network : cor_method = pearson, use_NetCoMi_pearson_spearman = TRUE, filter_thres = 0,001, puis cal_network : COR_p_thres = 0,01, COR_cut = 0,7) [57, 58]. Le package ggraph (version 2.1.0) a été utilisé pour visualiser les corrélations. Pour révéler les corrélations entre les micro-organismes et les paramètres chimiques, la fonction trans_env a été utilisée (use_data = espèces, cor_method = pearson, p_adjust_method : fdr).

Les résultats des analyses métagénomiques et métatranscriptomiques des enzymes glucidiques actives ont été visualisés par Circos en ligne (http://circos.ca/) et ggplot2. L'expression différentielle des gènes et l'analyse de l'enrichissement ont été effectuées par le package DESeq2 (1.34.0) implémenté dans R [59]. Les fichiers Quant de saumon (quants.sf) ont été importés dans R avec tximport (version 1.22.0 ; paramètres : type = salmon, txOut = TRUE) (https://github.com/mikelove/tximport). Nous avons filtré les décomptes pour conserver les gènes avec un minimum de 5 lectures sur 4 échantillons obtenus à partir d'alignements de saumon (numReads) et normalisés par DESeq2 (avec les paramètres par défaut ; tableau supplémentaire 5). Enfin, pour visualiser des gènes significativement différents, nous avons utilisé le package ggplot2 (en utilisant les paramètres suivants : log2 FC : ≥2,0, p ≤ 0,05).

Des échantillons ont été prélevés dans les digesteurs anaérobies de trois BP à l'échelle industrielle ("échantillons AD" et tableau supplémentaire 1). Le KBP était principalement alimenté avec du fumier de poulet et de la paille de blé prétraitée ; SZBP a été nourri avec du lisier de porc et de l'ensilage de maïs ; et boues d'épuration municipales traitées par MWBP contenant divers matériaux. Tous les digesteurs ont fonctionné à des températures mésophiles (c'est-à-dire de 36 °C à 38 °C) dans des réacteurs à cuve agitée en continu. Pendant la période de surveillance saisonnière (c'est-à-dire quatre points d'échantillonnage par BP), tous les réacteurs ont fonctionné de manière stable et aucune panne n'a été signalée.

Des tests BMP standard ont été effectués (voir détails dans "Détermination des paramètres chimiques AD") pour mesurer le potentiel maximum de biogaz des différentes communautés AD. Les rendements en méthane variaient de 340 mL (écart type : 2,6 mL) à 376 mL g VS−1 (SD : 14,6 mL). Bien que l'inoculum pour les tests BMP provienne de digesteurs alimentés avec des substrats distincts, les rendements en méthane étaient très similaires (Fig. 1A). De plus, les tests des points temporels d'octobre, janvier, avril et juillet ont tous montré des rendements de méthane similaires entre les trois usines de biogaz (Fig. 1B ; pour avril : KBP = 362 ± 14,6 ; MWBP = 356 ± 2,4 ; et SZBP = 365 ± 7,6 mL de méthane g VS−1). Dans des enquêtes antérieures, des gammes de potentiel de méthane similaires ont été observées dans les BP digérant divers types de biomasse d'origine agricole ou municipale [60, 61, 62].

A Résultats des mesures de test BMP standard de trois BP (voir : "échantillons AD"). B Rendement de méthane BMP sur les périodes testées. C Paramètres chimiques de digestion anaérobie des boues des digesteurs BP individuels (rapport C/N carbone sur azote, TAN azote ammoniacal total, VOAs acides organiques volatils, TIC carbone inorganique total, TS solides totaux, VS solides volatils). Les différences moyennes ont été analysées via ANOVA et considérées comme statistiquement significatives comme suit : p < 0,05 (*), p < 0,001 (**), ns pas de différence significative.

Bien que les principaux paramètres du processus chimique se situent dans des plages optimales [63, 64, 65], ils ont montré des différences claires entre les trois réacteurs BP (tableau supplémentaire 1). Les paramètres suivants ont été mesurés : les acides organiques volatils (VOA), le carbone inorganique total (TIC), l'azote ammoniacal total (TAN), le rapport carbone/azote (C/N), les solides totaux (TS) et les solides volatils (VS). Parmi ceux-ci, les concentrations de C/N, de VOA et de TAN ont montré la plus grande variabilité parmi les BP (ANOVA : p < 0,05) (Fig. 1C). Ces valeurs étaient généralement inférieures dans MWBP (p < 0,01) par rapport à celles dans KBP et SZBP [66].

Le binning semi-supervisé complété par l'apprentissage automatique (ML) est une approche récemment développée qui s'est avérée très bénéfique pour étendre les connaissances sur la génomique microbienne. Des recherches antérieures ont montré qu'un modèle spécifique à l'habitat basé sur ML améliore le processus de regroupement du métagénome pour les microbiomes complexes, surpassant la composition nucléotidique non supervisée existante et les méthodes basées sur l'abondance (c.-à-d. Metabat2) [35, 36]. Cependant, en raison d'une profondeur de lecture inhabituelle et d'une composition nucléotidique atypique, les gènes d'ARN ribosomique sont souvent absents des MAG récupérés à partir de données de séquençage à lecture courte [34, 44]. Ces gènes sont essentiels pour étudier la génomique et la phylogénie des micro-organismes non cultivés et permettent des analyses reliant les données MAG aux bases de données de gènes d'ARNr 16 S.

Dans la présente étude, plus de 296 millions de lectures de séquences métagénomiques ont réussi l'étape de filtrage (avec une moyenne de 24,6 millions de lectures par échantillon). Les lectures filtrées ont été co-assemblées par Megahit (trois assemblages indépendants par BP), ce qui a donné un total de 283 491 contigs (KBP : 107 920 ; MWBP : 98 415 ; SZBP : 77 156 contigs ; pour plus de détails, voir : Suppl. Tableau 2). Une stratégie de métagénomique centrée sur le génome a été suivie pour chaque ensemble de contigs co-assemblés. L'ensemble de MAG dérépliqué et filtré par qualité a ensuite été utilisé pour une analyse plus approfondie. Semibin a produit 297 nrMAG (nr = non redondant), dont 107 (36 %) étaient complets à plus de 90 %. Il convient de noter que 6 % des nrMAG ont été identifiés comme contenant 0 % de contamination et 90 % supplémentaires contenant> 5 % de contamination par analyse CheckM2 (Fig. 2A et B). De plus, 24% des nrMAG (n = 70) ont été identifiés à un niveau de qualité supérieur à celui de leurs représentants dans la base de données Genome Taxonomy (tableau supplémentaire 3). Ces observations confirment l'efficacité de Semibin en tant que procédure de binning pour les communautés anaérobies complexes productrices de biogaz [35]. En outre, le plus grand nombre de nrMAG uniques regroupés par Semibin peut également conduire à une meilleure cartographie des données de métatranscriptome.

Une comparaison de l'exhaustivité et de la contamination des génomes assemblés par métagénome non redondants (nrMAG) produits par Semibin et analysés par CheckM2 à l'aide de l'ensemble par défaut de SCG. B Distribution des nrMAGs reconstruites par Semibin en fonction de l'exhaustivité et de la contamination. Étant donné que dRep utilise CheckM1, la contamination des nrMAG peut différer des paramètres de filtrage dRep. C Estimation du nombre de copies du gène de l'ARNr 16 S pour 22 phylums (c'est-à-dire deux taxons d'archées et 20 taxons de bactéries). Pour certains embranchements, il a été possible de déterminer le nombre de copies d'un représentant : Methanobacteriota, Firmicutes F, Firmicutes D, Planctomycetota, Proteobacteria et Thermotogota.

Le programme MarkerMAG a ensuite été utilisé pour détecter, assembler et lier les gènes d'ARNr 16 S des métagénomes aux MAG et pour estimer le nombre de copies (voir : Matériels et méthodes "Métagénome assemblage et binning" et Tableau supplémentaire 3) [44]. Dans la présente étude, 16 gènes d'ARNr S (longueur minimale : 1200 nucléotides) ont été détectés dans 82 nrMAG répartis sur 22 phyla (représentant 28 % de tous les nrMAG). Les représentants des Firmicutes possédaient le nombre de copies moyen estimé le plus élevé de ce gène (3, 6 copies), tandis que les membres des Halobacteriota et Methanobacteriota présentaient les nombres de copies les plus faibles, avec une moyenne de 1, 3 copies chacun (Fig. 2C). Parallèlement aux rapports scientifiques précédents, nos données suggèrent que le séquençage des amplicons des gènes d'ARNr 16 S sous-estime l'abondance de la communauté archéenne dans la MA [67, 68]. Une méthode pour mieux estimer l'abondance microbienne dérivée du séquençage du gène de l'ARNr 16S consiste à normaliser les résultats via le nombre de copies par génome détecté [69]. Cependant, le nombre réel de copies du gène ARNr 16 S est inconnu pour de nombreux procaryotes [34]. Les solutions bioinformatiques actuelles pour normaliser les données de séquençage des amplicons reposent sur la conservation phylogénétique apparente des copies de gènes individuels, et cette hypothèse ne peut être valable que pour de courtes distances phylogénétiques [70]. La métagénomique résolue sur le génome combinée à la détection du gène de l'ARNr 16S peut aider à combler ce manque de connaissances.

Dans l'ensemble, nous avons constaté que les trois réacteurs AD abritaient des communautés microbiennes distinctes. La mise à l'échelle multidimensionnelle (MDS ; mise en œuvre à l'aide de la mesure de dissemblance de Bray-Curtis) a révélé que la variance de la composition du microbiome dans les trois usines de biogaz était significativement plus grande (PERMANOVA : p = 0,001) que la variance de la structure du microbiome dans les différents points d'échantillonnage de chaque usine de biogaz individuelle. Les microbiomes des différents BP ont montré des changements caractéristiques au fil du temps, mais dans chaque cas, ces changements étaient distinctifs pour cette plante (Fig. 3A). Cette découverte a été confirmée par des calculs de distance euclidienne, qui ont indiqué que les microbiomes de KBP et SZBP étaient plus similaires les uns aux autres qu'à MWBP (Fig. 3B). Conformément aux recherches antérieures, nos analyses ont confirmé que les microbiomes KBP et SZBP contenaient principalement des Bacteroidia, Clostridia et Limnochordia, tandis que le microbiome MWBP contenait des Bacteroidia, Anaerolineae et Actinomycetia (Fig. 3D) [29, 31, 71]. Nous pouvons donc conclure qu'il existe un paysage communautaire microbien commun qui comprend les principaux taxons trouvés dans les digesteurs de biogaz étudiés ici [3, 4].

A Mise à l'échelle multidimensionnelle des échantillons. Cette mesure indique les dissemblances Bray-Curtis de la communauté microbienne au niveau de l'annotation des espèces ou plus. Chaque symbole est lié à un échantillon BP spécifique. Oct, Jan, Apr et Jul indiquent les mois au cours desquels les échantillons ont été prélevés. B Distance euclidienne des échantillons BP. Cette mesure représente la dissemblance des communautés microbiennes au niveau de l'annotation des espèces ou plus. C Répartition taxonomique des nrMAGs au niveau du domaine pour les trois BP (en CPM %). D Répartition taxonomique des nrMAG. Cela montre les taxons les plus abondants dans les douze échantillons prélevés (c'est-à-dire chaque paire de points BP-temps) résolus au niveau taxonomique de la classe (indiqué en CPM %). Les noms rouges indiquent qu'ils ne sont pas dans le top 15 des classes les plus actives. E L'activité métatranscriptomique globale des micro-organismes archéens impliqués dans différentes voies méthanogènes (mélange : indique les nrMAG capables d'utiliser les trois voies méthanogènes). F Activité métatranscriptomique cumulée des nrMAG au niveau taxonomique du domaine pour les trois BP (indiquée en % TPM). G L'activité métatranscriptomique des nrMAGs. Sont indiqués les taxons les plus actifs présents dans les douze échantillons prélevés (c'est-à-dire chaque paire de points BP-temps) résolus au niveau taxonomique de la classe (indiqué en %). Les noms rouges indiquent qu'ils ne font pas partie des 15 classes les plus abondantes.

L'examen de l'abondance et de l'activité microbiennes à l'aide des distributions de données du métagénome et du métatranscriptome a révélé des modèles distincts. Sur la base de l'abondance relative (CPM %), les trois principales classes trouvées étaient Bacteroidia, Clostridia et Limnochordia, bien que l'activité (TPM%) de Methanosarcina ait surpassé les membres de ces classes. De plus, nous avons également trouvé des différences frappantes dans le rang et la composition taxonomique parmi les 15 nrMAG les plus actifs par rapport aux classes microbiennes les plus abondantes (Fig. 3D et G). Ainsi, l'abondance relative des micro-organismes diffère de l'activité métatranscriptomique relative. Dans l'ensemble, les représentants du domaine Archaea ont montré des activités plus élevées que l'abondance, comme en témoigne la comparaison des valeurs TPM% et CPM% (Fig. 3C et F; Tableaux supplémentaires 4 et 5). Ce phénomène a également été observé dans une communauté productrice de biogaz anaérobie [72].

Les archées méthanogènes identifiées par métatranscriptomique ne présentaient aucune différence significative dans l'activité globale entre les trois usines de biogaz à l'échelle industrielle (Fig. 3E). Cette observation indique que les archées méthanogènes présentent une fonctionnalité comparable, malgré les variations des conditions et des paramètres entre les différentes installations de biogaz. Cette résilience peut être due à la diversité des archées méthanogènes dans les digesteurs, ce qui peut fournir une redondance à la communauté productrice de méthane [19, 73, 74, 75].

Sur la base des ensembles connus de gènes marqueurs spécifiques à la lignée (SCG) et des données MIMAG, nous avons détecté 36 % de nrMAG de qualité élevée, 34 % de qualité moyenne et 30 % de faible qualité [76]. La base de données de taxonomie du génome (GTDB) a ensuite été utilisée pour l'attribution taxonomique des nrMAG reconstruits. Ces résultats ont montré que les nrMAG pouvaient être classés en 33 phylums, dont trois appartenaient aux archées et 30 aux bactéries (Fig. 4 et tableau supplémentaire 3).

La couleur de fond de l'arbre phylogénétique interne marque le phylum auquel ils appartiennent, le premier anneau indique le numéro nrMAG. Dans les deux anneaux suivants, les symboles représentent la présence de nrMAG spécifiques dans les bases de données Biogas Microbiome (vert) et GTDB (orange). Les symboles rouges marquent les sept nrMAGs qui ont une complétude élevée (>90%), une faible contamination (<5%) et qui n'ont été trouvées dans aucune base de données disponible (Archaea : MAG_165_3 ; Bacteria : MAG_114_1, _18_1, 29_1, 77_1, 87_1 et 95_2). Les symboles violets représentent les nrMAG de base. L'anneau extérieur représente les bactéries qui sont significativement plus répandues dans le BP particulier (en utilisant lefser, p < 0,05).

Les nrMAG ont été comparés à la base de données Biogas Microbiome, en utilisant l'outil fastANI pour calculer l'identité moyenne des nucléotides (ANI) [29]. Cette base de données contient un ensemble complet de génomes microbiens précédemment trouvés dans les digesteurs de biogaz. Nous avons constaté que 83 % des nrMAG reconstruits de haute qualité (exhaustivité> 90 % ; n = 107) étaient présents dans la base de données Biogas Microbiome (seuil ANI : 95 %). Il convient de noter que sept nrMAG de haute qualité, qui représentaient 7 % du total des nrMAG de haute qualité (n = 107) et 2 % de tous les nrMAG (n = 297), n'ont pu être associés à un représentant le plus proche dans l'une ou l'autre des bases de données. Ces nrMAG ont été jugés nouveaux car ils ne répondaient pas aux critères suivants : identification au niveau de l'espèce avec un rayon de référence de 95 % pour la GTDB et ≥ 95 % d'ANI pour le microbiome du biogaz (Fig. 4 et Suppl. Tableau 3). Il a été découvert que trois nrMAG de haute qualité contenaient également des séquences de gènes d'ARNr 16 S (tableau supplémentaire 3). De plus, les sept nouveaux nrMAG putatifs ont démontré une abondance et une activité élevées, représentant respectivement 3 % du nombre total par million (CPM) et 5 % du total des transcriptions par million (TPM) dans le microbiome examiné. Ces nrMAG peuvent être des membres de la matière noire microbienne supposée qui peut maintenant être libérée dans le domaine des participants connus des communautés AD.

L'analyse du microbiome central basée sur la métagénomique centrée sur le génome a été utilisée pour identifier les taxons potentiellement pertinents qui pourraient jouer un rôle dans la formation de la communauté microbienne centrale. Cette étude macroécologique a donc été étayée par des données de métatranscriptome (Fig. 5 et Supplémentaire Fig. 1) [37]. Ces analyses donnent un aperçu de la relation entre les nrMAG et les paramètres AD, ainsi que leurs rôles dans la formation du microbiome central.

Un diagramme de Venn indique le nombre total de nrMAG et le nombre de nrMAG partagés entre les trois BP (pourcentages indiqués). B Graphique ternaire montrant la distribution des nrMAG bactériennes et archéennes entre les BP. La couleur du point représente le phylum auquel appartiennent les nrMAG. La taille du point est proportionnelle à l'abondance totale (c'est-à-dire la valeur CPM cumulée dans tous les BP) de nrMAG spécifiques.

L'examen de la distribution des nrMAG reconstruits dans des usines de biogaz spécifiques a révélé que MWBP possédait le microbiome le plus unique des trois systèmes étudiés. KBP et SZBP ont montré des microbiomes qui se chevauchent quelque peu, comme en témoignent les calculs de distance MDS et euclidienne. Néanmoins, nous avons détecté 51 nrMAG dans les trois digesteurs (Fig. 5A). La plupart des nrMAG de base identifiés étaient des représentants de bactéries hydrolysantes bien connues (par exemple, Firmicutes, Bacteriodota) et de méthanogènes ayant des activités métaboliques polyvalentes (par exemple, Halobacteriota, Methanobacteriota). Ces micro-organismes jouent un rôle important dans le maintien de la productivité du biogaz et des performances durables du système [14, 77]. Bien que certains nrMAGs étaient présents dans tous les digesteurs, leur abondance variait considérablement. Parmi les bactéries centrales, les phylums Firmicutes, Firmicutes A et Bacteriodota ont été trouvés à la fois dans SZBP et KBP, tandis que les membres de Verrucomicrobiota, Armatimonadota et Chloroflexota prédominaient dans MWBP [6, 29, 66] (Figs. 4 et 5B).

Une analyse de cooccurrence des nrMAG a été réalisée et leurs corrélations avec les paramètres chimiques de la MA ont été calculées ("Analyse statistique") (Fig. 6). L'analyse du réseau de cooccurrence a démontré que la majorité des méthanogènes présentaient une corrélation positive avec les phylums Bacteroidota et Firmicutes. Les principaux paramètres influençant l'abondance des micro-organismes principaux étaient le TAN, les VOA et le TIC (rho de Pearson > 0,5). Sur la base de cette observation, huit groupes montrant des corrélations caractéristiques avec les paramètres chimiques AD ont été tracés (Fig. 6B). Les huit clusters peuvent être divisés en deux groupes, les micro-organismes des clusters I à V étant positivement corrélés aux principaux paramètres d'influence et les micro-organismes des clusters VI à VIII en corrélation négative avec ces paramètres. Nous avons également constaté que les nrMAG du noyau supérieur appartenant aux phylums Firmicutes, Spirochaetota et Methanobacteriota étaient positivement corrélés avec TAN, VOA et TIC, tandis que les membres du phylum Bacteroidota étaient également corrélés avec de nombreux paramètres mesurés. Enfin, le rapport C / N a montré un impact plus prononcé sur les Bacteroidota que sur les Firmicutes parmi les nrMAG du noyau supérieur (Fig. 6B).

A Corrélations de Pearson entre les noyaux nrMAG. La robustesse est calculée sous la valeur p significative ajustée est ≤ 0,05 et l'indice de corrélation (rho de Pearson) est > 0,7 basé sur le réseau. Les lignes bleues représentent les corrélations positives (rho de Pearson > 0,7), les lignes rouges représentent les corrélations négatives (rho de Pearson < −0,7). Un phylum marqué d'un astérisque n'est pas présent parmi les micro-organismes corrélés. B Corrélations de Pearson entre les nrMAG de base et les paramètres chimiques AD mesurés. Les astérisques représentent les corrélations significatives (considérées statistiquement significatives comme suit : p < 0,05 (*), p < 0,001 (**), p < 0,0001 (***), ns (pas de différence significative)). En utilisant le cladogramme illustré à gauche et les données pour TAN (azote ammoniacal total), VOA (acides organiques volatils), TIC (carbone inorganique total), TS (solides totaux) et C/N (rapport carbone sur azote), huit clusters ont été distingués. Ceux-ci sont représentés ici séparés par couleur comme suit : Groupe I : gris ; Groupe II : marron ; Groupe III : jaune ; Groupe IV : vert ; Groupe V : violet ; Groupe VI : bleu ; Grappe VII : orange ; et Groupe VIII : vert foncé. Les cases colorées représentent les embranchements spécifiques auxquels appartiennent les nrMAG. Les points rouges représentent les nrMAG les plus hydrolysées (n = 10).

Le genre Methanoculleus (phylum Halobacteriota, représentant les méthanogènes hydrogénotrophes) s'est avéré être une communauté diversifiée dans le microbiome central. Les espèces représentatives de Methanoculleus qui présentaient une corrélation positive avec les concentrations de TAN et de VOA étaient prédominantes dans KBP et SZBP, tandis que celles présentant une corrélation négative étaient plus répandues dans MWBP. De plus, ils coapparaissaient avec des membres des phylums Bacteroidota et Firmicutes. Les micro-organismes appartenant aux phyla Bacteroidota et Firmicutes peuvent produire des acides organiques, des alcools, de l'hydrogène (H2) et du dioxyde de carbone (CO2) via l'acidogenèse et l'acétogenèse, et nombre de ces micro-organismes existent en syntrophie avec des méthanogènes acétotrophes et hydrogénotrophes. Les méthanogènes hydrogénotrophes consomment de l'hydrogène via le transfert d'hydrogène interspécifique (IHT) et utilisent l'énergie provenant de la réduction du CO2 en méthane [78]. Les micro-organismes méthanogènes consommateurs d'hydrogène peuvent rapidement piéger l'hydrogène et maintenir la pression partielle d'hydrogène à un niveau bas. Cela conduit à une condition thermodynamiquement favorable pour que les bactéries acétogènes productrices d'hydrogène décomposent les composés organiques en acétate, H2 et CO2 [14, 79, 80].

Deux espèces d'archées méthanogènes, Methanoculleus sp002497965 et Methanospirillum sp0125200015 (désignées MAG_26_2 et MAG_103_2), ont été trouvées dans le groupe VI et ont montré une corrélation négative avec les espèces Methanoculleus bourgensis et Methanoculleus 1 appartenant aux groupes II et III. MAG_26_2 et MAG_103_2 étaient couramment présents dans le microbiome MWBP (Fig. 4). Methanoculleus sp002497965 et Methanospirillum sp0125200015 ont été initialement identifiés dans les microbiomes de la MA, mais à notre connaissance, des informations détaillées sur ces micro-organismes restent indisponibles [81,82,83,84].

Dans la présente étude, MAG_26_2 et MAG_103_2 ont été classés comme méthanogènes hydrogénotrophes stricts par des données métatranscriptomiques. De plus, ils présentaient une corrélation négative avec les concentrations de TAN et de VOA (rho de Pearson > -0,7). D'après les données génomiques, ces archées appartiennent à la classe des méthanogènes capables de maintenir une méthanogenèse hydrogénotrophe en utilisant le formiate comme donneur d'électrons. Typiquement, le formiate est oxydé en CO2 par la formiate déshydrogénase, après quoi il est encore réduit en méthane [85]. Ici, le transfert de formiate interspécifique (IFT) a été maintenu par des partenaires microbiens, à savoir SR-FBR-E99 sp002497965 et LD21 sp012519515 (du phylum Bacteroidota; MAG_72_3 et MAG_394_2), qui étaient positivement corrélés avec MAG_26_2 et MAG_103_2 (Fig. 6A). Ces MAG ont déjà été détectés dans des digesteurs de biogaz et ont été décrits pour leur capacité d'hydrolyse polyvalente. Outre l'utilisation des glucides, ce sont des micro-organismes dégradant les protéines et les acides aminés capables de produire du formiate. Ils ont également été systématiquement détectés aux côtés de méthanogènes utilisant du formiate [86].

Parmi les abondants noyaux nrMAG présents, nous avons identifié Methanothrix sp016706325 (MAG_97_2), un archéon apparemment capable de méthanogenèse acétotrophique (Fig. 1 supplémentaire). Sur la base de son profil de métatranscriptome MAG, il effectue principalement une méthanogénèse acétotrophique et peut absorber des électrons via un transfert direct d'électrons interspécifiques (DIET) pour entraîner une méthanogénèse réduisant le CO2. Nos données indiquent qu'il possède des voies de biosynthèse hautement actives de l'acétyl-CoA et du F420 ainsi qu'un transfert d'électrons actif associé à la membrane (protéine transmembranaire du cytochrome C; tableau supplémentaire 4). Selon une étude précédente, les espèces de Methanothrix présentent une plus grande activité lorsqu'elles tirent une partie de leur énergie du régime alimentaire plutôt que de compter uniquement sur l'acétate. Cependant, les informations sur leurs partenaires syntrophiques naturels sont limitées [87]. Cet archéon (avec Methanospirillum sp0125200015), est étroitement associé à Methanoculleus sp002497965. Il a été détecté que ce réseau d'archées coexiste avec les micro-organismes dégradant les acides aminés mentionnés précédemment (Fig. 6A). Ces micro-organismes ont également des cytochromes actifs de type C et une capacité de synthèse de pili, qui sont tous deux essentiels pour DIET (MAG_72_3 et MAG_394_2; Supplimentary Table. 5) [79, 88,89,90]. Au cours des processus métaboliques, des électrons peuvent être générés et transportés en réduisant des équivalents tels que la ferrédoxine réduite. Pour réoxyder ces porteurs d'électrons, la production de formiate peut permettre l'utilisation de voies d'élimination des électrons pour conserver l'énergie [86]. Ainsi, Methanothrix_sp016706325 (MAG_97_2) peut jouer un rôle essentiel dans la communauté productrice de biogaz en soutenant les voies d'élimination des électrons [91]. Sur la base des données de la littérature scientifique, ainsi que d'une analyse complète des digesteurs anaérobies dans les stations d'épuration danoises, les représentants de Methanothrix ont montré une corrélation négative avec les concentrations d'acétate et de TAN [66, 92, 93].

Les corrélations entre les communautés microbiennes et les paramètres des processus chimiques impliquent un mécanisme de transfert d'électrons distinct au cours de la DA de la biomasse agricole et des eaux usées. Ces processus sont corrélés négativement avec les niveaux de VOA et de TAN et se produisent généralement lorsque les voies d'élimination des électrons sont abondantes. Par exemple, nos données et des études antérieures suggèrent que les micro-organismes hydrolysant les protéines et dégradant les acides aminés - qui, selon la taxonomie GTDB, appartiennent au phylum Bacteroidota et à la famille VadinHA17 (tableau supplémentaire 3) - établissent des relations syntrophiques avec les méthanogènes hydrogénotrophes pour maintenir la production de formiate et éliminer les électrons via DIET [86].

Les enzymes glucidiques actives (CAZymes) sont responsables de la décomposition des glucides polymères. Pour caractériser cette étape limitant le débit, l'ensemble de données du métatranscriptome a été interrogé pour divers CAZymes et signes d'activité CAZyme à l'aide d'un ensemble de données combiné basé sur les bases de données Pfam et CAZy (Fig. 7). Les CAZymes identifiées ont ensuite été liées aux nrMAG (voir : "Assemblage et binning du métagénome").

Un graphique Circos illustrant les classes CAZyme identifiées et leur distribution d'activité à travers les phylums bactériens. Les enzymes ont été regroupées en cinq classes CAZyme. Les glycosyltransférases (GT) ont montré l'activité la plus élevée, suivies des glycoside hydrolases (GH), des modules de liaison aux glucides (CBM), des estérases glucidiques (CE) et des lyases polysaccharidiques (PL). Dans l'ensemble, l'activité GH et GT a été détectée dans tous les phylums microbiens observés. La plupart (51% TPM) de l'activité CBM était liée aux Firmicutes et Bacteroidota. B Carte thermique des familles d'enzymes glycoside hydrolases (GH) largement distribuées et communes. L'activité GH est spécifiée par des cases colorées. C Carte thermique des activités des familles d'enzymes du module de liaison aux glucides (CBM) et de la glycoside hydrolase (GH) pour les 30 principales espèces microbiennes (indiquées en valeurs log10 TPM). Les points rouges indiquent des nrMAG spécifiques présents dans la communauté principale (n = 10).

Parmi les CAZymes identifiées, les glycoside hydrolases (GHs) sont une famille majeure d'enzymes impliquées dans la dégradation des glucides complexes (Fig. 7A) [94]. Cette famille diversifiée d'enzymes comprend les cellulases, les hémicellulases, la pectine, l'inuline et diverses enzymes dégradant les oligosaccharides et l'amidon. Selon les données du métatranscriptome, la cellulase, l'hémicellulose et les enzymes dégradant l'amidon ont montré une activité élevée dans KBP et SZBP (Fig. 7B, C). Parmi plusieurs différences, les activités des cellulases (GH2 et GH3), des hémicellulases (GH43 et GH18) et des enzymes dégradant l'amidon (GH97 et GH31) étaient toutes significativement plus élevées dans KBP et SZBP par rapport à celles de MWBP (log2 FC : ≥ 2 ; p ≤ 0, 05) (Fig. 7B et tableau supplémentaire 5). Sur le plan taxonomique, les membres du phylum Bacteroidota (représentant 46 % de TPM de GH), Firmicutes G et Firmicutes A (12 % et 7 % de TPM de GH, respectivement) étaient les principaux contributeurs de l'activité de GH. Ces embranchements se sont avérés être les principaux dégradeurs de polysaccharides dans de nombreuses communautés productrices de biogaz [77, 95]. Néanmoins, nos données métatranscriptomiques suggèrent que les membres d'autres phylums tels que Actinobacteriota (8 % de TPM de GH), Chloroflexota (4 % de TPM de GH) et Spirochaetota (5 % de TPM de GH) expriment également des enzymes complexes dégradant les glucides (Fig. 7A) [29, 38]. Une évaluation quantitative combinée des modules de liaison aux glucides (CBM) et de l'activité de la GH a révélé que les 30 premiers nrMAG hydrolysants sont répartis sur plusieurs phylums (Fig. 7C).

Huit noyaux nrMAG ont été détectés parmi les nrMAG hydrolysants hautement actifs. Ces huit représentaient environ 35 % de l'activité totale des hydrolyseurs supérieurs (Fig. 7C). Nous avons trouvé que UBA1179_sp002340405 (MAG_187_1) et Fermentimonas sp019136875 (MAG_96_1) appartiennent au groupe I, UBA1402 sp002305085 (MAG_105_3) et Paludibacter sp012519425 (MAG_151_3) au groupe IV, et SR-FBR-E99 sp00 9881065 (MAG_72_3) et W0P28-013 sp012837685 (MAG_251_2) au groupe VII. (Fig. 6B et 7C). Les membres des hydrolyseurs du noyau supérieur appartenant aux groupes IV et I ont montré les interactions les plus répandues (Fig. 6A). Ces grappes ont été directement ou indirectement impliquées via l'IHT et ont montré des associations positives avec Methanoculleus bourgensis, Methanoculleus espèce 1, Methanobacterium sp012838205 et Methanoculleus sp012797575 (rho de Pearson 0,6–0,9). Cependant, le cluster a également montré une corrélation négative avec Methanospirillum sp0125200015, Methanothrix sp016706325 et Methanoculleus sp002497965. Ces derniers méthanogènes hydrogénotrophes et acétotropes capables d'IFT et de DIET coapparaissaient avec le groupe VII (rho de Pearson < -0,6). En général, les concentrations de TAN, de VOA et de TIC étaient positivement corrélées avec les nrMAG hydrolysant le noyau le plus actif dans les groupes I et IV (rho de Pearson> 0, 6). Cependant, il y avait des exceptions impliquant des micro-organismes appartenant au groupe VII.

Pour caractériser davantage la chaîne alimentaire productrice de méthane, nous avons effectué une analyse fonctionnelle des nrMAG en combinant les données du métatranscriptome et les données de la base de données KEGG (Fig. 8). L'analyse des modules KEGG a indiqué que la voie de la méthanogenèse était la plus active parmi toutes les voies principales (moyenne = 35 % de TPM de toutes les voies KEGG). Des études antérieures sur le métagénome ont considéré la méthanogenèse comme un "module rare" dans la communauté de production de biogaz [18, 29, 38] (Fig. 8A). Il est important de noter que si la méthanogenèse était en effet un module rare basé sur les données du métagénome, les données du transcriptome suggéraient le contraire [95, 96, 97, 98]. Compte tenu de cela, les analyses de métatranscriptome, qui quantifient les activités biologiques des micro-organismes dans des environnements complexes, fournissent une représentation plus précise de la vie microbienne et de l'activité microbienne se produisant au sein de la communauté que les études de métagénomique.

Une carte thermique des modules KEGG les plus actifs. Les 30 meilleurs modules KEGG des douze échantillons sont présentés sur la base des données métatranscriptomiques (affichées dans TPM). B Analyse en composantes principales des données fonctionnelles du module KEGG. Chaque symbole est lié à une paire BP-échantillon spécifique. C Gènes méthanogènes significativement différents identifiés dans les cinq méthanogènes les plus actifs. Sont présentées les différences considérées comme statistiquement significatives telles que calculées par DESeq2 (c'est-à-dire avec log2 FC > 2,0, p < 0,05). La carte thermique représente l'activité génique moyenne de chaque méthanogène dans les différents BP. Les blancs représentent des gènes qui n'étaient pas significativement différents dans le méthanogène fourni, ou le gène indiqué est absent dans le nrMAG donné.

Nous avons identifié l'oxydation du pyruvate, la voie d'Embden-Meyerhof et la voie des pentoses-phosphates comme modules centraux du métabolisme des glucides. Ces voies ont été appelées "modules de base" dans les précédentes enquêtes métagénomiques [29, 38]. Les sucres, issus de l'hydrolyse, peuvent être convertis en pyruvate via les voies Embden-Meyerhof et pentose-phosphate pour produire du CO2 et des électrons. De plus, la voie de l'acétyl-CoA, la biosynthèse des acides gras et la bêta-oxydation sont actives parmi les 30 principales voies liées à la fixation du carbone, comme cela a déjà été observé dans les réacteurs enrichis en fumier [29]. Cette découverte a été étayée par l'identification de nombreux modules actifs associés à la production d'énergie, d'acides aminés et de cofacteurs, qui sont tous essentiels au bon fonctionnement de l'écosystème de production de biogaz. Ensuite, nous avons découvert que KBP et SZBP partageaient une composition microbienne et un profil fonctionnel similaires, tandis que ceux de MWBP semblaient (basés sur les modules KEGG) être clairement distincts (Fig. 8B).

Pour évaluer les profils d'expression au niveau de la transcription, une analyse d'expression différentielle a été utilisée (voir : "Analyse statistique"). Nous avons détecté des altérations dans 11 383 gènes parmi les trois BP à l'aide de cette analyse à haute résolution (log2 FC > 2,0, p ≤ 0,05) (tableau supplémentaire 5). Il a été démontré que KBP et SZBP contiennent moins de gènes exprimés de manière différentielle (DEG) que ceux-ci par rapport à MWBP (Fig. 8B et Fig. 2 supplémentaire). Une enquête approfondie sur les DEG a trouvé 215 gènes impliqués dans la méthanogenèse. Les activités des sous-unités alpha, bêta et gamma de la méthyl coenzyme M réductase ont montré les changements les plus importants (log2 FC > 10, p < 0,0001). De plus, l'expression de gènes impliqués dans la méthanogénèse hydrogénotrophique, tels que la sous-unité ion-soufre de l'hydrogénase non réductrice F420 et de la méthylènetétrahydrométhanoptérine déshydrogénase, présentait des différences substantielles (log2 FC > 5, p < 0,001). L'acétyl-CoA synthétase a démontré des variances d'expression entre les gènes impliqués dans la méthanogénèse acétotrophique (log2 FC > 5, p < 0,001) [99]. La majorité des différentes activités géniques dans KBP étaient liées à Methanothrix A harundinaceae D (MAG_5_1), tandis que Methanothrix_sp016706325 (MAG_97_2) dans MWBP et Methanobacterium sp012838205, Methanoculleus sp12797575 et les espèces Methanosarcina (MAG_669_3, _57_1 et _165_3 ) dans SZBP (Fig. 8C).

Dans une communauté complexe productrice de biogaz, les archées méthanogènes utilisent diverses voies métaboliques et ensembles de gènes pour produire du méthane afin d'obtenir de l'énergie et de compenser leur abondance par leur activité. Selon des recherches antérieures, dans des conditions limitées en hydrogène, Methanococcus maripaludis présentait des niveaux élevés d'ARNm pour les gènes codant pour des enzymes, notamment l'hydrogénase non réductrice F420 et la méthylènetétrahydrométhanoptérine déshydrogénase, ce qui entraînait une augmentation de son taux de croissance [100]. Des résultats similaires ont été observés dans notre étude avec l'abondant Methanoculleus sp12797575 (MAG_57_1) dans SZBP. Ces enzymes ont démontré une activité élevée dans ce méthanogène hydrogénotrophe appartenant au groupe II, qui co-apparaissait avec les hydrolyseurs nrMAG JAAZLA01 sp012799545 ​​et UBA1361 sp002306335 (Fig. 6A). L'expression élevée de formiate déshydrogénase indique que MAG_57_1 utilise le formiate comme source d'hydrogène alternative (Fig. 8C) pour compenser son activité méthanogène. Cette activité est comparable aux espèces mixotrophes de Methanosarcina que l'on trouve couramment dans les SZBP (qui sont capables de conduire toutes les voies méthanogènes, cependant, aucun représentant au niveau de l'espèce n'a été identifié dans les bases de données GTDB et Biogas Microbiome ; MAG_165_3). Ceci est conforme aux conclusions des observations précédentes selon lesquelles la diversité métabolique de la communauté méthanogène est essentielle pour une production efficace de biogaz [74, 75].

Dans cette étude, nous avons reconstruit des nrMAG de haute qualité (génomes assemblés par métagénome non redondants) et effectué une analyse précise du métatranscriptome à l'aide d'un flux de travail de regroupement de réseaux neuronaux artificiels sur des échantillons AD prélevés dans des réacteurs de biogaz à l'échelle industrielle. Bien que les trois BP à l'échelle industrielle aient fonctionné avec des matières premières bien caractérisées et distinctes, nous n'avons observé aucune différence dans leurs rendements respectifs en méthane au cours de la période d'observation. La composition du microbiome et les répertoires fonctionnels des BP KBP et SZBP étaient plus similaires l'un à l'autre qu'à celui de MWBP. Plusieurs embranchements bactériens ont été identifiés comme les principaux micro-organismes hydrolysants. Une corrélation significative entre le microbiome central et les paramètres de fermentation tels que TAN, VOA et TIC suggère que le réseau d'interaction dans la communauté microbienne centrale AD est influencé par divers paramètres opérationnels chimiques. Les méthanogènes hydrogénotrophes (Archaea : Halobacteriota, Methanobacteriota) étaient dominants et positivement corrélés à la présence de représentants des phylums bactériens Firmicutes et Bacteroidota, avec lesquels ils s'engagent dans des transferts interspécifiques polyvalents. Des mécanismes de transfert d'électrons distincts utilisés par les méthanogènes hydrogénotrophes dans la MA ont également été trouvés dans la biomasse agricole et les eaux usées. Une espèce archée clé (Methanothrix sp016706325; MAG_97_2) a été détectée dans la communauté méthanogène centrale et joue probablement un rôle clé dans l'élaboration de la stratégie microbienne productrice de méthane. Notre étude a révélé que les archées méthanogènes de trois usines de biogaz à l'échelle industrielle maintenaient une activité globale similaire malgré les différences dans les conditions de fonctionnement et les paramètres mesurés. La présence d'une gamme variée d'archées méthanogènes dans les digesteurs peut améliorer la résilience de la communauté en offrant une redondance et une stabilité fonctionnelle, soulignant le rôle crucial de la diversité métabolique pour assurer une production efficace de biogaz. Cette découverte était également cohérente avec nos mesures de test BMP. Cependant, la présente étude de cas confirme que d'importantes lacunes subsistent dans notre compréhension des activités et des relations interspécifiques entre les membres des communautés productrices de biogaz. Ces lacunes peuvent être comblées, au moins en partie, par un cadre qui combine l'analyse du métagénome résolu par le génome avec une approche métatranscriptomique parallèle guidée par des algorithmes d'apprentissage automatique spécifiques, tels que des modèles spécifiques à l'habitat.

Les séquences brutes du métagénome et du métatranscriptome générées et analysées au cours de la présente étude ont été déposées au NCBI SRA sous le numéro d'accession PRJNA929705. Des nrMAGs de haute qualité (compl. >90% cont. <5%) sont déposés dans le NCBI SRA sous les numéros d'accès de SAMN32989584 à SAMN32989690. Les principales données générées ou analysées pour cette étude sont reprises dans cet article publié et ses fiches d'information complémentaires. Les flux de travail et les scripts R sont disponibles auprès du premier auteur sur demande raisonnable.

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Roland Wirth a conçu et réalisé les analyses bioinformatiques et rédigé le manuscrit. Teur Teur Sally Cheung et Zoltán Bagi ont réalisé les expériences et effectué des mesures analytiques. Prateek Shetty a contribué aux analyses méta-omiques. Kornél L. Kovács et Gergely Maróti ont conçu l'étude, rédigé le manuscrit et discuté de la littérature pertinente. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Cette étude a été financée en partie par les projets du Fonds national hongrois pour la recherche, le développement et l'innovation (NRDIF) : RW, BZ et GM ont reçu le soutien des projets PD132145, FK142500, FK123902, FK123899, K143198 et ÚNKP-22-5-SZTE-537. Ce travail a également été soutenu par la bourse Lendület-Programme (GM) et Bolyai (WR) de l'Académie hongroise des sciences (LP2020-5/2020 et BO/00449/22) et par le programme de laboratoire national Széchenyi Plan Plus (Laboratoire national pour les sciences de l'eau et la sécurité de l'eau, RRF-2.3.1-21-2022-00008). BZ et KLK ont reçu le soutien de 2020-3.1.2-ZFR-KVG-2020-00009 et 2019-2.1.13-TÉT_IN-2020-00016. Financement en libre accès fourni par ELKH Biological Research Center.

Institut de biologie végétale, Centre de recherche biologique, Szeged, Hongrie

Roland Wirth, Prateek Shetty & Gergely Maróti

Département de biotechnologie, Université de Szeged, Szeged, Hongrie

Roland Wirth, Zoltán Bagi, Márk Szuhaj, Teur Teur Sally Cheung & Kornél L. Kovács

Faculté des sciences de l'eau, Université de la fonction publique, Baja, Hongrie

Gergely Maróti

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Correspondance à Gergely Maróti.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Wirth, R., Bagi, Z., Shetty, P. et al. Interactions inter-royaumes et stabilité des méthanogènes révélées par l'analyse multi-omique guidée par l'apprentissage automatique d'usines de biogaz à l'échelle industrielle. ISME J (2023). https://doi.org/10.1038/s41396-023-01448-3

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Reçu : 08 février 2023

Révisé : 23 mai 2023

Accepté : 26 mai 2023

Publié: 07 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41396-023-01448-3

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