Application d'organoïdes immunostimulés dans la modélisation de la recherche personnalisée sur le carcinome à cellules de Merkel

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 13865 (2022) Citer cet article

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Le carcinome à cellules de Merkel (MCC) est un cancer cutané neuroendocrine rare, avec une incidence inférieure à 1/100 000, de faibles taux de survie et une réponse variable à la chimiothérapie ou à l'immunothérapie. Ici, nous explorons l'application des organoïdes tumoraux patients (PTO) dans la modélisation de la recherche personnalisée dans cette tumeur maligne rare. Des cellules tumorales MCC non triées et non expansées ont été isolées à partir d'échantillons chirurgicaux et mises en suspension dans un hydrogel à base d'ECM, ainsi que du sang et des tissus de ganglions lymphatiques appariés par le patient pour générer des organoïdes renforcés immunitaires (iPTO). Les organoïdes ont été traités avec des agents de chimiothérapie ou d'immunothérapie et l'efficacité a été déterminée par la viabilité post-traitement. Neuf échantillons provenant de sept patients ont été recrutés de décembre 2018 à janvier 2022. Le taux d'établissement était de 88,8 % (8/9) pour les PTO et de 77,8 % (7/9) pour les iPTO. L'histologie sur des tissus de patients et des PTO appariés a démontré l'expression de marqueurs MCC. La réponse à la chimiothérapie a été observée dans 4/6 (66,6 %) échantillons avec le cisplatine et la doxorubicine comme agents les plus efficaces (4/6 ensembles de PTO), tandis que l'immunothérapie n'était pas efficace dans les ensembles iPTO testés. Quatre échantillons provenant de deux patients ont démontré une résistance au pembrolizumab, en corrélation avec la réponse au traitement du patient correspondant. L'établissement de routine et l'amélioration immunitaire des PTO MCC sont réalisables directement à partir d'échantillons chirurgicaux réséqués, ce qui permet une recherche et une exploration personnalisées des schémas thérapeutiques dans le cadre préclinique.

Le carcinome à cellules de Merkel (MCC) est un cancer cutané neuroendocrine rare et agressif avec une incidence annuelle estimée à 0,7 cas pour 1 000 0001 et des résultats de survie pires que le mélanome. Alors que les premières recherches suggéraient que le MCC provenait de la crête neurale, des preuves plus récentes indiquent des progéniteurs épidermiques2,3. La transformation maligne résulte d'une séquelle d'infection par le polyomavirus à cellules de Merkel (MCPyV) dans environ 60 à 80 % des cancers MCC, tandis que dans un sous-ensemble plus restreint de patients, elle est liée à l'exposition aux UV4, les deux événements augmentant de manière synergique la charge mutationnelle et la néoantigénicité des tumeurs MCC.

La plupart des patients atteints de CCM présentent une maladie loco-régionale qui nécessite une résection chirurgicale suivie d'une radiothérapie adjuvante chez certains patients4. Chez les patients atteints d'une maladie métastatique, les options sont limitées, tandis que la rareté du CCM rend difficile le recrutement de patients pour des études comparatives avec de nouveaux agents5,6. Il existe un intérêt croissant pour les inhibiteurs de points de contrôle ainsi que pour le développement d'un vaccin MCPyV7,8,9. Cependant, malgré des résultats prometteurs avec l'immunothérapie qui ont abouti à l'approbation de la FDA en 2017, comme pour de nombreux autres cancers, la résistance acquise des tumeurs reste un problème sérieux avec la toxicité liée à l'immunothérapie10. Ainsi, il est important de prédire l'échec potentiel du traitement pour éviter les effets indésirables liés au traitement dans les cas où un bénéfice de survie n'est pas attendu.

En raison de la faible incidence du CCM, des options alternatives aux essais cliniques sont nécessaires pour déterminer l'efficacité du traitement préclinique. Nous avons déjà signalé une modélisation organoïde réussie de plusieurs types de tumeurs, notamment le mésothéliome, le poumon, l'appendice, le mélanome, le sarcome et les primaires colorectales11,12,13,14,15,16. Fait important, certaines de ces études ont analysé des sous-types de tumeurs rares qui ont connu peu de progrès dans la gestion clinique au cours des dernières décennies. Ces organoïdes ont été créés avec succès dans un système d'hydrogel hautement contrôlé composé de collagène et d'acide hyaluronique, éliminant la nécessité d'un extrait de membrane basale xénogénique pour la culture. Les PTO étaient prêts pour les tests précliniques dans la semaine suivant la fabrication, fournissant des données de traitement dans un délai pertinent pour potentiellement soutenir et éclairer les décisions cliniques. Ces études ont pu démontrer un potentiel d'utilité dans les applications de médecine de précision pour les thérapies approuvées et expérimentales12,15,17,18.

Nous montrons ici la faisabilité de ces approches dans le développement de PTO pour créer une plate-forme de recherche clinique personnalisée pour le MCC au niveau de chaque patient. Nous démontrons la biofabrication des PTO MCC à partir de tissus de patients réséqués et montrons une similitude dans les marqueurs tissulaires pour les tumeurs. Nous avons analysé l'utilisation de schémas de chimiothérapie expérimentaux et de traitements d'immunothérapie approuvés pour une efficacité comparative. Enfin, nous avons pu comparer les résultats de résections temporellement distinctes d'un même patient avec leur résultat clinique. Nous pensons que les données présentées mettent en valeur l'utilité des PTO dans la recherche sur le MCC et, à l'avenir, potentiellement en tant qu'outil compagnon préclinique dans les tumeurs malignes rares.

Neuf échantillons de tumeurs provenant de sept patients ont été acquis au cours de la période d'étude de décembre 2018 à janvier 2022 (tableau 1). Huit des tumeurs ont fourni suffisamment de cellules pour produire des organoïdes pour le dépistage thérapeutique. Un patient a subi une deuxième et une troisième opération pour une maladie récurrente alors qu'il était sous immunothérapie et les deux échantillons supplémentaires ont été transformés en organoïdes. De plus, sept tissus ont fourni suffisamment de cellules tumorales avec des échantillons séparés pour les lymphocytes pour des tests d'immunothérapie parallèles, avec six ensembles utilisant le sang du patient et un ensemble utilisant un ganglion lymphatique réséqué (Fig. 1). Après la biofabrication, les PTO ont été cultivés pendant 7 jours et ont subi 3 jours de tests de dépistage de drogue. Dans l'ensemble, les résultats du dépistage des médicaments pour tous les échantillons étaient disponibles dans les 10 jours, éliminant le besoin d'expansion cellulaire et générant des données spécifiques au patient dans un délai cliniquement pertinent.

Organigramme de la fabrication d'organoïdes du carcinome à cellules de Merkel. Les cellules tumorales ont été isolées du tissu tumoral digéré et transformées en PTO, tandis que les cellules immunitaires ont été isolées du sang du patient ou du tissu lymphatique et combinées avec des cellules tumorales pour créer des iPTO. Ces organoïdes ont été cultivés pendant 1 semaine, après quoi ils ont été caractérisés et criblés pour leur efficacité thérapeutique. Créé avec BioRender.com.

Le maintien des cellules tumorales primaires dans la culture organoïde est essentiel pour une représentation précise des tissus et une réponse appropriée à l'intervention thérapeutique. La coloration comparative des tissus réséqués et des PTO a démontré un niveau élevé de correspondance pour l'identification des taches (Fig. 2 et Fig. S1 supplémentaire). Une morphologie cellulaire similaire est présentée dans les tissus de patients et les PTO appariés, tandis que les iPTO ont démontré des populations de cellules immunitaires (Fig. 2a, b, i et ii). Les expressions positives de Pan-Cytokeratin et de CK20 sont couramment utilisées pour différencier le MCC d'autres origines tumorales, y compris le mélanome et d'autres tumeurs neuroendocrines métastatiques (Fig. 2a, b, iii et iv)19. Tirant son nom de la lignée des neurones sensoriels des cellules de Merkel dont il peut être dérivé, le MCC démontre également une expression positive de marqueurs neuronaux, notamment la synaptophysine, le neurofilament et la chromogranine20. Il a également été démontré que ces marqueurs ont une corrélation élevée entre le PTO et le tissu appariés (Fig. 2a, b, v – vii). De plus, on suppose que le polyomavirus à cellules de Merkel (MCPyV) joue un rôle important dans le développement de la maladie, jusqu'à 80 % des cas de patients sont porteurs du virus. Nous avons observé une expression positive dans 5 tumeurs de patients sur 7 (71%) (Fig. 2a, b, viii). La coloration IHC des PTO et des tissus a démontré un manque d'expression pour CD45 et S100, éliminant les diagnostics alternatifs qui simulent morphologiquement le MCC, y compris le lymphome et le mélanome, respectivement (Fig. S2 supplémentaire).

Immunohistochimie de tissus de patients appariés (Bx) et ensemble PTO de carcinome à cellules de Merkel (a) MCC5 et (b) MCC7. La comparaison des tissus et des PTO montre une grande concordance des marqueurs d'identification, notamment (i) la morphologie cellulaire (H&E), (ii) la morphologie cellulaire de l'iPTO (H&E), (iii) la pancytokératine (Pan CK), (iv) la cytokératine 20 (CK20), (v) le neurofilament (NFH), (vi) la chromogranine A (ChgA), (vii) la synaptophysine (SYP et (viii) le polyomavirus à cellules de Merkel (MCPyV). De plus, les ensembles MCC5 (a) et MCC7 (b) ont démontré une expression variable de marqueurs liés à l'identification de la maladie et aux résultats potentiels, y compris MCPyV. Toutes les images prises à un grossissement de 40 × avec une barre d'échelle de 20 μM.

Pour confirmer la faisabilité des PTO dans le dépistage thérapeutique, les PTO ont été traités avec une série de chimiothérapies actuellement utilisées en milieu clinique (Figs. 3, 4). Dans l'ensemble, la réponse au traitement variait entre les PTO et les traitements, le régime le plus efficace étant une combinaison de cisplatine et de doxorubicine (4/6, 66 %). L'analyse des régimes combinatoires peut éventuellement aider à déterminer les composants efficaces de chaque régime sur une base patient par patient ou à concevoir de nouveaux protocoles thérapeutiques. Par exemple, l'ensemble PTO MCC2 a affiché une réponse significative à la combinaison de cisplatine et de doxorubicine, mais une analyse plus approfondie de la réponse individuelle montre que la réponse n'est pas synergique mais principalement due à la cytotoxicité de la doxorubicine (Figs. 3, 4ai – iii). En revanche, l'ensemble PTO MCC5 utilisait la même combinaison, mais la réponse individuelle suggère que le cisplatine est responsable de l'efficacité du régime (Figs. 3, 4i–iii).

Le dépistage par chimiothérapie du PTO démontre une hétérogénéité intertumorale dans la réponse au traitement tumoral. Les pourcentages sont la viabilité par rapport aux organoïdes témoins appariés par les patients. Les doses des traitements indiqués dans le tableau sont les suivantes : cisplatine (10 μM), doxorubicine (1 μM), vincristine (1 μM), étoposide (1 μM), cisplatine/doxorubicine (10 μM/1 μM), cisplatine/étoposide (10 μM/1 μM) et vincristine/doxorubicine (1 μM/1 µM). Les cases vertes représentent les traitements entraînant une diminution de la viabilité < 50 % et p > 0,05, les cases jaunes > 50 % ou p < 0,05, les cases rouges représentent les traitements avec une diminution de la viabilité > 50 % et p < 0,05. L'essentiel est le nombre d'ensembles de PTO dans lesquels le traitement est efficace (< 50 % viable et p < 0,05). La colonne à l'extrême droite représente le nombre de traitements efficaces dans l'ensemble organoïde patient respectif.

Application de la plateforme de traitement de chimiothérapie personnalisée pour (a) MCC2 et (b) MCC5 avec (i) Cisplatine. (ii) Doxorubicine. (iii) Vincristine. (iv) Étoposide. (v) Cisplatine/Doxorubicine. (vi) cisplatine/étoposide et (vii) vincristine/doxorubicine. Résumé des résultats du test CellTiter-Glo 3D pour (a) le MCC2 démontre des réponses au traitement dépendantes de la dose pour (i) le cisplatine (ii) la doxorubicine (iii) le cisplatine/doxorubicine et (vii) la vincristine/doxorubicine tandis que (b) le MCC5 illustre ces résultats pour (i) le cisplatine et (iii) le cisplatine/doxorubicine. Sous chaque dose, répliques répertoriées comme points de données. *p < 0,05.

Pour étudier efficacement les mécanismes à l'origine de l'efficacité de l'immunothérapie, nous avons incorporé des cellules immunitaires isolées à partir de sang total ou de tissu de ganglions lymphatiques normaux dans nos cultures de PTO pour former des organoïdes tumoraux de patients immuno-renforcés (iPTO). Après sept jours de culture, un traitement d'immunothérapie a été réalisé à l'aide de trois traitements approuvés pour le MCC : pembrolizumab, ipilimumab et nivolumab. Sur la base de nos critères d'efficacité du traitement iPTO de < 50 % de viabilité iPTO par rapport au contrôle avec une signification statistique pour le contrôle iPTO apparié et le traitement apparié PTO, les tests de viabilité de l'ATP et la microscopie confocale n'ont pas confirmé d'effet immunothérapeutique significatif sur nos organoïdes immunitaires pour aucun des sept ensembles iPTO testés, avec une plage de viabilité post-traitement de (55-110 %) pour pembrolizumab, ipilimumab (63-108 %) et pour nivolumab (74–120 %) (Fig. 5). L'analyse IHC des organoïdes traités a démontré une cytotoxicité à médiation immunitaire minimale mesurée par l'activité du granzyme B et de la caspase 3 dans les cellules tumorales tout en démontrant la présence de lymphocytes T CD8 + au cours de la période d'étude par rapport aux témoins (Fig. 6a), Figs supplémentaires. S3, S4, S5). La mesure d'un marqueur de stress cellulaire et de lésions tissulaires, la LDH, à plusieurs moments après le traitement pour MCC7 et MCC9 a montré des niveaux inférieurs de LDH à 24 et 48 h pour MCC9, suggérant une résistance de l'iPTO au traitement au début du traitement (Fig. 6bi, ii).

Démonstration des iPTO dans les applications de test d'immunothérapie. ( a ) Les ensembles iPTO ont été traités avec des immunothérapies et la viabilité a été enregistrée avec CellTiter-Glo 3D. Aucun iPTO n'a été déterminé comme ayant une réponse significative de < 50 % de viabilité par rapport au contrôle, une signification statistique de p < 0,05 par rapport au contrôle iPTO et au contre-traitement de la PTO à toutes les immunothérapies testées. (b) Panneau LIVE/DEAD pour MCC8. Les barres d'échelle représentent 250 microns. *p < 0,05.

Analyse comparative de tumeurs temporellement séparées chez un même patient. ( a ) L'immunohistochimie des iPTO démontre des populations de cellules t CD8 + robustes, mais une faible destruction médiée par le granzyme B des cellules CK20 +. (b) L'analyse du stress cellulaire LDH détermine une augmentation de pembrolizumab MCC7 iPTO set mais pas de MCC9, suggérant l'acquisition d'une résistance entre les deux tumeurs chez ce patient. Toutes les images prises à un grossissement de 40X avec une barre d'échelle de 20 μM. *p < 0,05.

L'intégration des PTO dans un modèle préclinique nécessite une corrélation clinique. Au total, quatre échantillons chirurgicaux ont été obtenus longitudinalement chez 2 patients, à différents moments au cours de leur traitement par pembrolizumab (tableau 1). Le premier patient (MCC3) s'est initialement présenté avec une lésion primaire du visage avec des zones supplémentaires concernant l'activité tumorale métastatique dans le médiastin et le bassin sur l'imagerie TEP/CT. Ce patient a subi une résection du MCC primaire du visage et a commencé le pembrolizumab adjuvant, subissant 4 perfusions avant de passer de la maladie avec les iPTO correspondants présentant une viabilité post-traitement de 56 % (Fig. 3).

Le deuxième patient (ensembles iPTO MCC2, MCC7, MCC9), a développé une récidive faciale (MCC2), 10 ans après la résection initiale des extrémités du MCC. La TEP/TDM a mis en évidence de nouvelles zones de métastases sur plusieurs sites du visage et du cou. Sept cycles de pembrolizumab adjuvant ont entraîné une réponse clinique mitigée au traitement. Plus précisément, une réponse a été observée au niveau des lésions métastatiques du cou alors que le patient développait une progression de la maladie avec une nouvelle lésion faciale en transit qui a été réséquée pour un contrôle local pendant que le patient était maintenu sous traitement (MCC7). Deux cycles supplémentaires de perfusions de pembrolizumab n'ont pas empêché le développement d'une nouvelle tumeur faciale à croissance rapide (MCC9) qui a également été réséquée. La comparaison des traitements de chimiothérapie PTO a démontré une résistance accrue à la plupart des traitements à agent unique et des schémas thérapeutiques combinés (Fig. 3). Les iPTO MCC2 n'ont pas démontré de sensibilité du patient envers le pembrolizumab (86 % de viabilité post-traitement). La lésion récurrente (MCC7) a démontré une viabilité de 57 % post-pembrolizumab et une augmentation de la LDH à 24, 48 et 72 h après le traitement par pembrolizumab (Figs. 5a, 6bi). Enfin, MCC9 n'a pas démontré de sensibilité au pembrolizumab avec une viabilité post-traitement de 119 %, une diminution des niveaux de LDH et un manque d'activité du granzyme B et de la caspase 3 (Figs. 3, 5a, 6bii). L'expression de la granzyme B et de la caspase 3 dans les cellules tumorales PTO CK20 + traitées a diminué lors de la comparaison de l'ensemble iPTO MCC2 aux ensembles ultérieurs MCC7 et MCC9 (Fig. S5 supplémentaire).

Les progrès de la recherche sur le MCC ont longtemps été entravés par le manque de modèles tissulaires et la rareté des maladies. Ici, nous décrivons la création de PTO à partir d'échantillons chirurgicaux réséqués sans expansion cellulaire qui permet une disponibilité opérationnelle et des tests rapides dans la semaine suivant la génération. Plusieurs régimes de chimiothérapie et d'immunothérapie ont été comparés pour l'efficacité cytotoxique, démontrant le potentiel de sélection de traitements personnalisés pour chaque patient et la capacité d'évoluer pour le dépistage thérapeutique dans les essais précliniques. En outre, la réponse clinique à l'immunothérapie de quatre échantillons de MCC provenant de deux patients était concordante avec la réponse présentée par leurs iPTO correspondants. L'optimisation de ces PTO peut accroître notre compréhension de ce cancer rare et éventuellement améliorer la sélection des traitements systémiques.

Depuis le premier développement des PTO, il a été émis l'hypothèse qu'ils pourraient servir de modèle comparatif pour la sélection de la thérapie des patients en plus de leur capacité en tant que modèle de recherche pour de nouvelles thérapies. En effet, plusieurs études ont démontré une valeur prédictive positive et négative élevée pour les PTO de divers types de tumeurs21,22,23,24. Bien que les dosages corrélant la PTO et la réponse clinique varient, une diminution substantielle de la viabilité ou de la croissance de la PTO a été couramment utilisée comme seuil d'efficacité cytotoxique et de corrélation. En utilisant un seuil strict de 50 % de réduction de la viabilité pour déterminer l'efficacité, nous avons montré des corrélations positives et négatives de PTO dans des études antérieures sur le mélanome et le cancer de l'appendice15,18. Dans cette étude, nous avons également évalué la viabilité via la microscopie confocale et le contenu en LDH, mais ceux-ci n'ont été utilisés que comme tests de support en raison du faible débit. Une corrélation iPTO avec la réponse clinique a été observée dans quatre échantillons précédemment traités avec du pembrolizumab adjuvant, un inhibiteur de PD-1. Les ensembles iPTO développés à partir d'échantillons réséqués non-répondants ont démontré la présence de cellules CD8 + avec de faibles niveaux de Granzyme B, une viabilité cellulaire post-traitement> 50% et une diminution des niveaux de LDH suggérant une faible activité cytotoxique dans les iPTO malgré la présence d'inhibiteurs de point de contrôle. Les résultats organoïdes présentés ici sont artificiellement biaisés vers l'absence de réponse immunothérapeutique parce que les patients correspondants échouaient à l'immunothérapie et que la chirurgie n'était pratiquée que pour obtenir un contrôle local. Par conséquent, ces résultats ne peuvent pas être utilisés pour suggérer que l'immunothérapie ne fonctionne pas pour les tumeurs à cellules de Merkel. Une étude multicentrique de phase 2 a observé un taux de réponse de 56 % (14/25) chez les patients traités par pembrolizumab25. La réponse mixte à l'immunothérapie qui a été observée cliniquement ainsi que la diminution de l'expression de ces marqueurs histologiques dans les lésions réséquées progressant sous immunothérapie est une indication de l'évolution clonale avec des clones malins coexistants présentant des réponses différentielles au traitement. Il s'agit d'une démonstration claire que toute réponse présentée par les PTO ne reflète que les lésions biopsiées utilisées pour développer les organoïdes et n'est pas nécessairement représentative de la réponse globale du patient dans les cas où la clonalité tumorale existe dans des tumeurs spatialement distinctes.

L'immunothérapie pour le MCC a été approuvée pour la première fois en 2017, et depuis lors, plusieurs agents ont été développés et ont montré qu'ils amélioraient la survie des patients25,26,27. Une fonction immunitaire altérée est liée à une prévalence accrue de MCC, donc28 l'amélioration de la reconnaissance immunitaire des cellules tumorales peut apporter des avantages substantiels aux patients traités29. Le polyomavirus des cellules de Merkel est identifié chez environ 80 % des patients, créant à la fois une signalisation pro-oncogène et anti-apoptotique dans les cellules affectées30,31. En affichant une expression appariée fiable de MCPyV dans les tumeurs excisées et les PTO appariés, la plate-forme organoïde présentée peut s'avérer utile pour étudier et développer des vecteurs antiviraux ou le développement de vaccins MCC dans les cas où des cellules présentant l'antigène appariées par le patient sont incorporées dans les conditions de co-culture7,18.

Le taux d'établissement du PTO de 89 % rapporté ici correspond à d'autres grandes études utilisant des cancers plus courants tels que le côlon et le sein21,32 (tableau 1). Notre étude utilise un hydrogel hautement caractérisé capable de réticulation contrôlée fournissant des résultats cohérents et reproductibles capables de soutenir les cellules tissulaires primaires sans avoir besoin de facteurs xénogéniques. Des travaux supplémentaires avec les PTO peuvent permettre la création et le déploiement d'hydrogels avec des compositions hautement personnalisées pour correspondre au tissu d'intérêt. Le flux de travail de 10 jours pour la biofabrication d'organoïdes décrit pour générer des résultats de chimiosensibilité et d'immunosensibilité, présente un outil de recherche translationnelle capable d'une intégration transparente avec les besoins cliniques d'un patient et, après validation, pourrait potentiellement changer le paysage de la façon dont les cliniciens gèrent les décisions de traitement, de l'analyse de cohorte aux décisions personnalisées. Ceci est particulièrement important pour les tumeurs rares où les données des essais cliniques font défaut. Enfin, les PTO nous ont permis d'évaluer la synergie de plusieurs combinaisons de chimiothérapies (Fig. 3). Les patients pourraient être épargnés par une toxicité inutile si les schémas thérapeutiques combinatoires pouvaient être distingués du médicament le plus efficace dans les cas où la synergie n'est pas observée. Les travaux ci-dessus démontrent l'importance de détourner les tissus des banques traditionnelles de tumeurs de tissus "morts" vers des biodépôts de tissus vivants.

Bien que nous ayons pu créer et tester un nouveau modèle de prise de force pour MCC, il reste plusieurs limites à notre recherche. La puissance modeste de l'étude est un effet direct de la rareté du MCC. La corrélation clinique n'a pas été possible avec tous les échantillons car un certain nombre de patients avaient des contre-indications à recevoir un traitement systémique, y compris l'immunothérapie5. La corrélation clinique présentée décrit une valeur prédictive négative, car de nombreux spécimens réséqués provenaient de tumeurs cliniquement résistantes au traitement systémique. Cependant, il est logique que la survie des patients soit finalement déterminée par les clones non-répondeurs. Par conséquent, l'identification des non-répondeurs est importante pour éviter les traitements inefficaces ainsi que la toxicité et le coût associés au traitement. L'établissement d'une valeur prédictive positive sera un critère d'évaluation nécessaire dans les études futures. Enfin, bien que la radiothérapie soit une option de traitement potentielle pour le MCC, nous n'avons pas intégré ce paramètre de traitement dans notre étude comme décrit précédemment dans d'autres primaires33.

Malgré les promesses des PTO dans la recherche sur le MCC et d'autres cancers rares, les organoïdes ne sont pas encore prêts à être appliqués dans la pratique clinique sans données corrélatives suffisamment puissantes avec les résultats pour les patients. L'introduction d'organoïdes comme outils corrélatifs dans les essais cliniques randomisés prospectifs est la voie à suivre pour aller de l'avant avec une caractérisation génomique et protéomique approfondie. L'établissement de routine et l'amélioration immunitaire des PTO MCC sont réalisables directement à partir d'échantillons chirurgicaux réséqués, ce qui permet une recherche et une exploration personnalisées des schémas thérapeutiques dans le cadre préclinique.

Toutes les méthodes ont été réalisées selon les directives institutionnelles conformément aux politiques de Wake Forest Baptist Health.

Des échantillons de tissus, de sang et de ganglions lymphatiques ont été obtenus auprès de patients adultes informés et consentants atteints de MCC subissant une résection entre décembre 2018 et janvier 2022. Les échantillons ont été obtenus selon un protocole IRB approuvé par le Wake Forest Human Research Protection Program. Les spécimens ont été placés dans les médias du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) et transférés au Wake Forest Organoid Research Center (WFORCE) pour traitement dans un cadre postopératoire de 2 heures.

Lors de la réception des tissus, les tumeurs ont été lavées dans une solution saline tamponnée au phosphate avec 100 U/mL de pénicilline-streptomycine, 5 mg/mL de gentamicine et 5 mg/mL d'amphotéricine B pendant deux cycles de 5 minutes. Dans la mesure du possible, une partie de chaque échantillon a été prélevée et utilisée pour l'histologie ; cela a été effectué si les tissus étaient suffisamment grands pour préparer des études organoïdes. Les échantillons ont été hachés et placés dans un conique de 15 ml dans une solution de 3 ml de milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 100 000 unités CDA/mL de collagénase HA (001-1050 ; VitaCyte, Indianapolis, IN), 22 000 unités/mL de protéase (003-1000 ; VitaCyte) et 200 U/mL de DNAse 1 (07470 ; STEMCELL, Cambridge, MA) par gramme de tissu pendant 60 min sous agitation à 37 °C. Une fois la dissolution complète des tissus, la digestion enzymatique a été terminée avec un milieu de culture froid contenant du FBS et la solution tumorale résultante a été filtrée à travers un kit de filtration sous vide (SCNY0060; Millipore Sigma, Burlington, MA), puis centrifugée pour isoler le culot cellulaire. Le surnageant a été retiré et le culot cellulaire a été remis en suspension avec le tampon de lyse des globules rouges (Abcam, Cambridge, Royaume-Uni) conformément au protocole de la société. Le tampon de lyse a été retiré et les cellules ont été comptées à l'aide d'un NucleoCounter NC-200 (Chemometec, Danemark). Du sang total a été prélevé sur des patients pour la récupération de lymphocytes à l'aide de Ficoll-Paque PLUS et du protocole correspondant (GE Healthcare, Chicago, États-Unis). Un ganglion lymphatique normal d'un patient a été obtenu pour la fabrication d'iPTO. Les ganglions lymphatiques ont été traités de manière similaire au tissu entier comme décrit ci-dessus.

Le culot de cellules tumorales a été remis en suspension avec un hyaluronane/héparine modifié au thiol (Heprasil ; Advanced Biomatrix, San Diego, CA) préparé selon les instructions du fabricant avec 0,1 % p/v d'Irgacure 2959 (5200, Advanced BioMatrix, San Diego, CA) ajouté comme photo-initiateur et 3 mg/mL de solution de collagène méthacrylé (PhotoCol ; Advanced Biomatrix) dans un rapport volumique de 1:3 à un densité cellulaire de 10 millions de cellules/mL. Des organoïdes tumoraux dérivés du patient (PTO) ont été créés en ensemençant 5 µL du mélange hydrogel/cellule dans des puits individuels d'une plaque traitée par culture non tissulaire à 96 puits et photoréticulés par exposition à la lumière ultraviolette (365 nm, 18 W/cm2) d'une lampe UV BlueWave 75 V.2 (Dymax Corp., Torrington, CT) pendant 1 s pour réticuler les organoïdes. Les PTO ont été cultivées dans un milieu de 200 ml contenant du DMEM-F12 avec 5 % de FBS, 1 % de pénicilline-streptomycine, 1 % de l-glutamine, 50 ng/mL d'EGF (PHG 0313 ; ThermoFisher Scientific), 10 µM Y-27632 (S1049, Selleckchem, Houston, TX) avec changement de milieu tous les 3 à 4 jours.

Des PTO à renforcement immunitaire (iPTO) ont été créés en combinant les cellules immunocompétentes du sang total du patient (iPTO sanguin) ou du tissu lymphatique nodal (iPTO lymphatique) dans un rapport de 3: 1 à 5: 1 selon le rendement cellulaire avec les cellules tumorales et ensemencées sur des plaques comme décrit ci-dessus. Les organoïdes, en plus des cellules tumorales et CD8+, contiennent des cellules CD4+ et APC, ainsi que du stroma comme décrit précédemment15,18. Les organoïdes ont été cultivés pendant 7 jours avant le traitement.

Les organoïdes ont ensuite été traités après 7 jours de culture. Les chimiothérapies comprenaient le cisplatine (1, 10, 100 µM) (232120, Sigma Aldrich), la doxorubicine (0,1, 1, 10 µM) (S1208, Selleckchem), la vincristine (0,1, 1, 10 µM) (V8879 Sigma Aldrich), la doxorubicine avec cisplatine (0,1/1, 1/10, 10/100 µM), cisplatine avec étoposide (S1125, Selleckchem) (1/0,1, 10/1, 100/10 µM) (Selleckchem) et doxorubicine avec vincristine (0,1/0,1, 1/1, 10/10 µM). Pour le traitement par immunothérapie, 100 nM de pembrolizumab (A2002, Selleckchem), d'ipilimumab (A2001, Selleckchem) ou de nivolumab (A2005, Selleckchem) ont été utilisés sur les iPTO et les PTO dans des traitements parallèles. Le milieu a été retiré des puits et des solutions médicamenteuses mélangées dans le milieu de culture ont été ajoutées. Les organoïdes sont restés dans la solution de milieu traité pendant 72 h avant l'évaluation de la viabilité du point final.

Après 3 jours d'incubation dans des milieux contenant du médicament, les organoïdes ont été évalués avec des tests de viabilité de cytotoxicité LIVE/DEAD, CellTiter-Glo 3D et LDH-GLO. La coloration LIVE/DEAD (L3224 ; Invitrogen, Carlsbad, CA) a été réalisée selon le protocole du fabricant et incubée à 37 °C pendant 2 h avant l'imagerie. L'imagerie fluorescente a été réalisée à l'aide d'un macro microscope confocal Leica TCS LSI (Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL). Les images des canaux rouges et verts ont été superposées et empilées en projection maximale.

La viabilité quantitative a été évaluée en utilisant CellTiter-Glo 3D Cell Viability (G968B; Promega, Madison, WI) et les tests de cytotoxicité LDH-GLO (J2381; Promega). La LDH (Lactose Déshydrogénase) est une enzyme qui catalyse plusieurs étapes nécessaires à la formation d'énergie pour la cellule. La libération de LDH est un marqueur de stress cellulaire et peut être utilisée en clinique pour mesurer les lésions tissulaires. En observant de petites augmentations de ce marqueur, il est possible de s'assurer que ces cellules ne subissent pas de stress ou de dommages cellulaires, ce qui peut être utilisé comme mesure non lytique des dommages cellulaires par opposition à CellTiter-Glo 3D, au prix d'une diminution du débit d'analyse. Pour le test de viabilité cellulaire CellTiter-Glo 3D, la moitié du milieu (100 ml) a été retirée des puits individuels et 100 ml de réactif de test ont été ajoutés à chaque puits, suivis d'une incubation à température ambiante sur un agitateur pendant 30 min. Le test de cytotoxicité LDH-GLO a été réalisé en préservant le milieu de culture des jours 1, 2, 3 après le traitement et en exécutant le test le même jour selon les spécifications du fabricant. Le contenu des puits pour les deux dosages a été transféré dans une plaque de dosage à 96 puits en polystyrène blanc Costar (3912; Corning, NY) et analysé avec un luminomètre pour microplaques Veritas (Turner BioSystems, Sunnyvale, CA).

Les organoïdes ont été fixés pour l'histologie au jour 10 de la culture dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 4 h. Les organoïdes ont été traités, inclus dans la paraffine et sectionnés à des intervalles de 5 μm pour la coloration. Des coupes d'organoïdes et de tissus ont été colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine (H&E).

L'immunohistochimie chromogénique a été réalisée pour identifier les populations de PTO et de cellules tissulaires. La récupération de l'antigène a été réalisée sur des lames non colorées en utilisant un tampon citrate pH 6. Les tissus et organoïdes ont été incubés avec Cytokeratin 20 (CK20, ab76126, Abcam), Pan-Cytokeratin (Pan-CK, NBP2-29429, NOVUS, Centennial, CO), Neurofilament (NFH, 13-1300, Thermofisher, Waltham, MA), Synaptophysin (SYP, MA5-14532, Thermofisher), Chromogranin A (ChgA , ab15160, Abcam) et les anticorps primaires de l'antigène T du polyomavirus des cellules de Merkel (MCPyV, MABF2316, Millipore Sigma) pendant la nuit. Une incubation appropriée de l'anticorps secondaire biotinylé (abcam) a suivi pendant 1 h. Les lames ont ensuite été exposées à une solution de DAB (SK-4105, Vector Laboratories, Burlingame CA, USA) pendant deux minutes et contre-colorées avec de l'hématoxyline. L'imagerie a été réalisée sur un microscope Olympus BX-63 (Olympus, Tokyo, Japon).

Une coloration supplémentaire a été réalisée avec l'immunohistochimie fluorescente (IHC) pour caractériser la réponse au traitement d'immunothérapie iPTO. Les lames non colorées ont subi une récupération d'antigène dans une solution tampon de citrate à pH 6 avant d'être bloquées avec Dako Protein Block pendant 30 min. L'IHC fluorescente a été réalisée avec des anticorps pour la caspase 3 clivée (9661S, Cell Signaling Technologies, Danvers MA), CD-8 (ab4055, abcam), CK-20 (MA5-13263, Invitrogen) et granzyme B (ab4059, abcam) sur des lames dans des rapports de 1: 500, 1: 200, 1: 200, 1: 100, 1: 4 00, respectivement. Après incubation pendant une nuit à 4 ° C, des anticorps secondaires Alexa Fluor 488 ou Alexa Fluor 594 réactifs aux espèces appropriées (Biotium, Fremont, CA) ont été appliqués aux échantillons pendant 1 h à une dilution de 1: 1000. Les sections ont ensuite été incubées avec du DAPI pendant 5 min avant la finalisation avec une lamelle. Un microscope à fluorescence vertical Olympus BX-63 a été utilisé pour imager les coupes. La quantification des pixels pour l'imagerie fluorescente a été réalisée à l'aide du logiciel ImageJ FIJI.

Il n'y a pas de consensus sur ce qui représente l'efficacité thérapeutique dans les organoïdes. Ici, nous utilisons une approche conservatrice pour considérer qu'un organoïde réponde à la thérapie, consistant en trois critères distincts qui doivent être simultanément remplis par les iPTO : (1) démontrer une réduction statistiquement significative de la viabilité cellulaire par rapport aux organoïdes non traités (témoins) (Ex : iPTO contrôle vs iPTO traité), et (2) démontrer une réduction statistiquement significative de la viabilité cellulaire lorsque l'on compare les organoïdes traités des conditions immunitaires renforcées aux non-immunisées renforcées (Ex : iPTO traité par immunothérapie vs PTO traité par immunothérapie), et (3) présentent une viabilité post-immunothérapie CellTiter-Glo 3D < 50 %.

De même, les PTO améliorés non immuns doivent répondre à deux critères : (1) démontrer une réduction statistiquement significative de la viabilité par rapport aux organoïdes témoins de PTO non traités et (2) présenter une réduction de la viabilité post-thérapie CellTiter-Glo 3D de > 50 %. Nous avons arbitrairement sélectionné une réduction de la viabilité de 50 % comme seuil le plus bas suggérant une réponse au traitement. Ce nombre peut être modifié en fonction de la réponse tumorale souhaitée à étudier ou de la cinétique et de la biologie tumorale de chaque patient, démontrant la plasticité de la plateforme.

Toutes les données sont exprimées en moyenne ± écart type pour chaque groupe expérimental. Chaque combinaison de conditions consistait en 3 organoïdes ou plus pour l'analyse. Les valeurs de test CellTiter-Glo 3D des organoïdes traités ont été standardisées sur des contrôles correspondant à l'état (iPTO ou PTO) avant l'analyse statistique. Deux échantillons de tests t ont été utilisés pour évaluer si la viabilité cellulaire était différente entre les groupes de comparaison souhaités. Un seuil rigoureux a été choisi pour déterminer si un groupe de traitement a montré une réponse au traitement. Ce seuil nécessite que toutes les conditions de réponse au traitement (identifiées dans la section précédente) soient remplies pour considérer un organoïde comme étant une réponse au traitement. Cette approche a été utilisée pour diminuer la probabilité qu'une erreur de type 1 se produise. Plus précisément, la probabilité que les deux tests t décrits ci-dessus soient tous deux significatifs à p < 0,05 (plutôt que parce que les deux indiquaient la preuve d'une réponse au traitement) serait de 0,25 %. De plus, si la probabilité qu'une viabilité post-immunothérapie CellTiter-Glo 3D inférieure à 50 % soit un événement aléatoire (c'est-à-dire 50 % de chances qu'il se produise par hasard), la probabilité combinée que les trois événements se produisent simultanément par hasard serait de 0,125 % ou 12,5 sur 10 000 pour les études d'immunothérapie. Les études de criblage de médicaments ont été jugées réussies pour un patient si les PTO témoins non traités démontraient une viabilité adéquate au jour 10 de la culture, ce qui coïncidait avec la fin des criblages de médicaments. Une viabilité adéquate est décrite comme une valeur à blanc < 1 % de la condition de contrôle. L'analyse statistique a été réalisée avec GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., USA).

Les ensembles de données générés et/ou analysés au cours de l'étude actuelle ne sont pas accessibles au public en raison du risque d'informations d'identification du patient basées sur la rareté de la maladie, mais sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Nous reconnaissons gracieusement le travail de Libby McWilliams, Matthew Ebert et Kathleen Perry (Atrium Health Wake Forest Baptist Medical Center) pour leur aide dans l'approvisionnement en tissus et la gestion des données. SDF est soutenu par une subvention des National Institutes of Health (T32CA247819). KIV reconnaît le financement du NIH/NCI R01CA249087, R01CA258692, de la Mesothelioma Research Foundation et du Wake Forest Comprehensive Cancer Center.

Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest School of Medicine, Winston-Salem, Caroline du Nord, États-Unis

Steven D. Forsythe, Preston Laney, Hemamylammal Sivakumar, Aleksander Skardal, Shay Soker et Konstantinos I. Votanopoulos

Département de biologie du cancer, Wake Forest School of Medicine, Winston-Salem, Caroline du Nord, États-Unis

Steven D. Forsythe, Aleksander Skardal, Shay Soker et Konstantinos I. Votanopoulos

Centre de recherche sur les organoïdes de Wake Forest (WFORCE), Winston Salem, États-Unis

Steven D. Forsythe, Richard A. Erali, Preston Laney, Shay Soker et Konstantinos I. Votanopoulos

Département de chirurgie, Division d'oncologie chirurgicale, Wake Forest Baptist Health, Wake Forest University, Medical Center Boulevard, Winston Salem, Caroline du Nord, 27157, États-Unis

Richard A. Erali & Konstantinos I. Votanopoulos

Wake Forest Comprehensive Cancer Center, École de médecine de Wake Forest, Winston Salem, États-Unis

Richard A. Erali, Shay Soker et Konstantinos I. Votanopoulos

Département de génie biomédical, Université d'État de l'Ohio, Columbus, OH, États-Unis

Hémamylammal Sivakumar & Aleksander Skardal

Département de pathologie, Wake Forest School of Medicine, Winston-Salem, Caroline du Nord, États-Unis

Wencheng Li

Ohio State University et Arthur G. James Comprehensive Cancer Center, Columbus, OH, États-Unis

Alexandre Skardal

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SDF et RAE ont planifié et réalisé les expériences et contribué à la rédaction du manuscrit. HS et PL ont réalisé les expériences. WL a fourni l'analyse des images et contribué à l'écriture. AS et SS ont planifié les expériences et contribué à l'écriture. KIV a fourni des spécimens, planifié les expériences et contribué à la rédaction du manuscrit.

Correspondance à Konstantinos I. Votanopoulos.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Forsythe, SD, Erali, RA, Laney, P. et al. Application d'organoïdes améliorés immunitaires dans la modélisation de la recherche personnalisée sur le carcinome à cellules de Merkel. Sci Rep 12, 13865 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-17921-6

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Reçu : 08 mars 2022

Accepté : 02 août 2022

Publié: 16 août 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-17921-6

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