Évaluation de méthodes d'extraction pour des études métabolomiques non ciblées pour de futures applications dans des modèles d'infection de larves de poisson zèbre

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 7489 (2023) Citer cet article

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La préparation des échantillons en métabolomique non ciblée doit permettre des extractions reproductibles d'autant de molécules que possible. Ainsi, l'optimisation de la préparation des échantillons est cruciale. Cette étude a comparé six procédures d'extraction différentes pour trouver la plus appropriée pour extraire les larves de poisson zèbre dans le contexte d'un modèle d'infection. Deux extractions en une phase utilisant du méthanol (I) et une seule phase miscible de méthanol/acétonitrile/eau (II) et deux méthodes en deux phases utilisant une séparation de phases entre le chloroforme et des combinaisons de méthanol/eau (III et IV) ont été testées. Une homogénéisation supplémentaire des billes a été utilisée pour les méthodes III et IV (III_B et IV_B). Neuf étalons internes et 59 molécules d'intérêt (MoInt) liées à l'infection mycobactérienne ont été utilisés pour l'évaluation de la méthode. Les méthodes à deux phases (III et IV) ont conduit à un nombre de caractéristiques inférieur, à des zones de pic plus élevées de MoInt, en particulier des acides aminés, et à des coefficients de variation plus élevés par rapport aux extractions à une phase. L'ajout de l'homogénéisation des billes a augmenté le nombre de caractéristiques, les zones de pic et les CV. L'extraction I a montré des surfaces de pic plus élevées et des CV plus faibles que l'extraction II, ce qui en fait la méthode à une phase la plus adaptée. Les extractions III et IV ont montré des résultats similaires, III étant plus facile à exécuter et moins sujet aux imprécisions. Ainsi, pour de futures applications dans la métabolomique des larves de poisson zèbre et les modèles d'infection, les extractions I et III pourraient être choisies.

La métabolomique vise à profiler analytiquement les changements de molécules < 1500 Da (métabolome) présentes dans un organisme ou un système modèle à un certain moment1,2. Le métabolome comprend des métabolites endogènes ainsi que des métabolites provenant de sources exogènes telles que des médicaments. Alors que les approches ciblées sont basées sur la quantification de métabolites sélectionnés, souvent issus d'un groupe particulier de métabolites, la métabolomique non ciblée vise à détecter autant de métabolites que possible1,2,3. Les techniques analytiques souvent appliquées pour la séparation des échantillons comprennent la chromatographie liquide (LC) et la chromatographie en phase gazeuse, qui sont toutes deux régulièrement couplées à la spectrométrie de masse1,2,3. La séparation LC dans les approches non ciblées est souvent effectuée à l'aide de colonnes en phase inversée pour la séparation des métabolites non polaires, de colonnes en phase normale pour la séparation des métabolites polaires ou de colonnes de chromatographie liquide à interaction hydrophile (HILIC) en tant que variantes des colonnes en phase normale, utilisant une couche d'eau au-dessus de leur phase stationnaire, ce qui entraîne une séparation basée principalement sur la séparation liquide-liquide. Les colonnes Phenyl-Hexyl sont des colonnes en phase inverse avec une sélectivité unique pour les molécules aromatiques. Après séparation des métabolites, ils sont ionisés, généralement en utilisant l'ionisation par électrospray (ESI) ou l'ionisation à pression atmosphérique et analysés à l'aide d'un analyseur de masse, souvent Orbitrap ou des instruments à temps de vol1,2. Les spectres de fragmentation peuvent être générés dans la même analyse en utilisant par exemple une acquisition dépendante des données ou indépendante des données, ou dans une analyse ultérieure. Les données ainsi générées peuvent ensuite être traitées à l'aide de méthodes bioinformatiques telles que la détection et le prétraitement des pics, suivies de statistiques multivariées pour l'évaluation et la comparaison des spectres de fragmentation par rapport aux bibliothèques de référence pour l'identification1,2,3,4,5.

Pour comprendre l'effet des maladies, par exemple la tuberculose6, et trouver un biomarqueur pour un diagnostic ou un succès de traitement, la métabolomique est souvent appliquée et le changement du métabolome de l'hôte est observé. Plus précisément, les modifications du métabolome endogène provenant de l'infection à Mycobacterium tuberculosis ont été largement étudiées chez l'homme4,5,6,7 et des modèles animaux8, notamment des souris, des cobayes, des lapins et des primates non humains9. Les modifications induites sur le métabolome ont également été étudiées en utilisant la mycobactérie non tuberculeuse M. marinum dans les larves de poisson zèbre (Danio rerio, ZF) comme l'un de ses hôtes naturels10. Un tel modèle ZF utilisant M. marinum ressemble aux structures de type granulome, que l'on trouve généralement chez son homologue mammifère11,12,13,14. Le génome ZF est identique à environ 70 % à celui de l'homme15 et dans plusieurs études, un métabolisme similaire à celui de l'homme, à la fois en ce qui concerne le métabolisme xénobiotique16,17,18,19, ainsi que le métabolome de l'hôte en cas d'infection20,21 a été rapporté. Le modèle de larves ZF présente d'autres avantages, notamment la facilité de manipulation, la transparence optique des embryons et des larves, et des coûts monétaires inférieurs, par rapport à d'autres organismes22,23. De plus, les expériences réalisées avec des embryons et des larves de moins de 120 h après la fécondation (hpf) ne sont pas considérées comme des expérimentations animales au sein de l'Union européenne (directive européenne 2010/63/UE)24. En raison de la multitude d'avantages, les études ZF utilisant la métabolomique non ciblée sont de nos jours de plus en plus courantes25,26, mais rarement utilisées dans le contexte des maladies et de M. marinum en particulier20.

Au cours des études préliminaires menées pour la mise en œuvre d'un modèle d'infection par M. marinum dans les larves de ZF, le manque de matériel d'échantillon en raison de la petite taille des larves de ZF a conduit à une faible intensité du signal des métabolites et a entraîné des métabolites manqués et une mauvaise répétabilité. L'optimisation des méthodes employées, en particulier la préparation des échantillons, a été jugée nécessaire. Pour couvrir une partie suffisamment importante du métabolome, des combinaisons de différentes méthodes d'extraction, de séparation ou d'identification sont souvent utilisées1,2,3,27,28.

Les extractions liquides couramment utilisées pour les larves de ZF et d'autres tissus de poisson sont souvent basées sur des extractions en une phase, qui consistent en un ou plusieurs solvants miscibles, tels que le méthanol, l'acétonitrile et l'eau29 ou uniquement le méthanol19. Ils sont également basés sur des méthodes biphasiques, constituées de deux solutions non miscibles30, utilisant une séparation de phase entre une phase lipophile et hydrophile. Les méthodes à deux phases les plus courantes utilisent une solution polaire, par exemple des mélanges de méthanol et d'eau et une solution apolaire, par exemple le chloroforme31,32, le méthyl tert-butyl éther33 ou l'heptane34.

Une autre approche consiste à appliquer une homogénéisation supplémentaire de l'échantillon. Alors que certains échantillons de tissus peuvent être extraits directement à l'aide de solvants, les tissus plus résistants nécessitent des étapes de décomposition supplémentaires. Ces méthodes comprennent l'homogénéisation chimique, qui présente l'inconvénient d'interférer éventuellement avec le métabolome ou les processus d'extraction suivants, ou l'homogénéisation mécanique des larves par exemple par broyage, battage des larves avec des billes ou ultra-sonification35.

Cette étude visait à comparer différentes procédures d'extraction d'échantillons, y compris une phase, deux phases et deux phases avec homogénéisation mécanique, afin de trouver la plus appropriée pour une utilisation future dans un modèle d'infection de larves de M. marinum ZF. Différentes méthodes ont été étudiées sur la base de multiples stratégies d'évaluation de la qualité, impliquant des normes internes, appelées «molécules d'intérêt» (MoInt), et les pièges ainsi que les améliorations ont été élucidés.

La pronase et le bleu de méthylène ont été obtenus auprès de Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Allemagne). NaCl, KCl, MgSO4, Ca(NO3)2 et l'acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES) ont été obtenus auprès de Carl Roth (Karlsruhe, Allemagne). Le tryptophane-d5 a été obtenu auprès d'Alsachim (Illkirch Graffenstaden, France). Le telmisartan-d7 a été acheté chez Sigma (Taufkirchen, Allemagne). La trimipramine-d3, le bisoprolol-d5, le furosémide, le glibenclamid et l'hydrochlorothiazide ont été obtenus auprès de LGC (Wesel, Allemagne). Le formiate d'ammonium, l'acétate d'ammonium (tous deux de qualité analytique), l'acide formique (de qualité LC-MS), le d-glucose-d7 et l'acide palmitique-d31 ont été achetés auprès de Merck (Darmstadt, Allemagne). L'acétonitrile (ACN, qualité LC-MS), le méthanol (MeOH, qualité LC-MS) et tous les autres produits chimiques et réactifs (qualité analytique) provenaient de VWR (Darmstadt, Allemagne). Le chloroforme (qualité réactif analytique) provenait de Fisher (Schwerte, Allemagne). L'eau déionisée a été produite par un système Millipore (résistance à l'eau de 18,2 Ω × cm) de Merck (Darmstadt, Allemagne). Les tubes de réaction et les embouts de pipette ont été obtenus auprès de Sarstedt (Nümbrecht, Allemagne). Des tubes d'homogénéisateur de 2 ml préremplis de billes de verre de 0,5 mm lavées à l'acide ont été obtenus auprès de Biozym (Hess, Allemagne).

L'élevage de ZF adultes a été effectué conformément à la loi allemande sur la protection des animaux (§11 Abs. 1 TierSchG) et sur la base de méthodes précédemment documentées19,36. Les larves de ZF dans les 120 premières HPF ne sont pas considérées comme des expérimentations animales conformément à la directive européenne 2010/63/UE. L'entretien du poisson zèbre, la préparation des embryons et la collecte des échantillons jusqu'à la préparation des échantillons peuvent être trouvés dans le matériel supplémentaire.

Deux extractions à une phase (I-II) et deux extractions à deux phases (III-IV) ont été étudiées, l'extraction I étant utilisée pour les expériences préliminaires. Les extractions en deux phases ont en outre été évaluées en combinaison avec un prétraitement mécanique, en utilisant une homogénéisation aux billes de verre.

Pour l'homogénéisation des billes, indiquée par "_B" dans les résultats, des billes de verre de 0,5 mm provenant de tubes d'homogénéisation préremplis (Biozym, Hess, Allemagne) ont été ajoutées aux échantillons congelés par choc. Les échantillons ont été homogénéisés à l'aide d'un homogénéisateur MP Biomedicals FastPrep24 (TF, Dreieich, Allemagne) pendant 20 s à 6 m/s en mode Quick Prep et conservés ensuite sur de la glace. Trois solutions de pointe différentes (1, 2 et 3), contenant différents IS ont été utilisées lors de l'extraction. Leur contenu et la sélection maximale de l'IS, ainsi que m/z et le temps de rétention peuvent être trouvés dans le tableau S1.

Pour l'extraction I, adaptée de Park et al., 180 μL de MeOH et 20 μL de solution d'étalon interne 1 (25 μg/mL de tryptophane-d5, 1 mg/mL d'acide palmitique-d31, 50 μg/mL de glucose-d7 dans MeOH) ont été ajoutés à chaque échantillon19. Les échantillons ont été vortexés pendant 10 s puis centrifugés à 4 °C et 21 500 xg pendant 10 min.

Pour l'extraction II, adaptée de Bai et al., 80 µL de MeOH, 100 µL d'ACN et 40 µL d'eau Millipore, ainsi que 20 µL de solution de pointe 1 ont été ajoutés à chaque échantillon29. Les échantillons ont été soniqués à l'aide d'un nettoyeur à ultrasons USC 100T (VWR, Darmstadt, Allemagne) pendant 15 min à température ambiante, incubés à - 20 ° C pendant 2 h, puis centrifugés à 4 ° C et 21 500 × g pendant 15 min.

Pour les extractions III et III_B, adaptées de Chai et al., 180 µL de MeOH et 80 µL d'eau Millipore, ainsi que 20 µL de solution de pointe 1 ont été ajoutés à chaque échantillon37. 200 µL de chloroforme et 100 µL d'eau Millipore ont été ajoutés et les échantillons ont été vortexés pendant 1 min. Les échantillons ont été incubés sur de la glace pendant 10 min puis centrifugés à 4 °C et 13 800 xg pendant 10 min.

Pour les extractions IV et IV_B, adaptées de Ding et al., 80 µL de MeOH et 100 µL d'eau Millipore, ainsi que 20 µL de solution de pointe 1 ont été ajoutés à chaque échantillon20. 200 µL de chloroforme ont été ajoutés et les échantillons ont été soniqués à l'aide d'un nettoyeur à ultrasons USC 100T (VWR, Darmstadt, Allemagne) pendant 15 min. Les échantillons ont été incubés sur de la glace pendant 10 min puis centrifugés à 4 °C et 2400 xg pendant 5 min. Les flux de travail de chaque procédure d'extraction individuelle peuvent être trouvés dans les Figs. 1 et 2.

Flux de travail pour les procédures d'extraction I et II. MeOH Méthanol, ACN Acétonitrile. Solution Spike 1 25 µg/mL tryptophane-d5, 1 mg/mL acide palmitique-d31, 50 µg/mL glucose-d7 dans MeOH. Généré par BioRender.com et publié en fonction de leurs conditions de licence académique.

Flux de travail pour les procédures d'extraction III (III B) et IV (IV B). MeOH Méthanol, ACN Acétonitrile. Solution Spike 1 25 µg/mL tryptophane-d5, 1 mg/mL acide palmitique-d31, 50 µg/mL glucose-d7 dans MeOH. Généré par BioRender.com et publié en fonction de leurs conditions de licence académique.

Pour les extractions III, IV, III_B et IV_B, la phase lipophile inférieure a été rejetée et n'a pas été analysée davantage car la configuration analytique comprenant l'ionisation ESI n'était pas optimisée pour les métabolites lipophiles, ainsi que la plupart des molécules d'intérêt et des normes internes étant hydrophiles.

Après chaque procédure d'extraction, le surnageant de chaque échantillon a été transféré dans des flacons en verre brun et conservé à - 80 ° C pendant la nuit. Un volume de 10 µL de solution de pointe 2 (1 µg/mL de trimipramine-d3 et 50 µg/mL de glibenclamide dans MeOH) a été ajouté, et le solvant a été éliminé à l'aide d'une centrifugeuse sous vide (Eppendorf, Hambourg, Allemagne) à 30 °C, en utilisant le réglage pour solutions alcooliques sous vide (V-AL) pendant jusqu'à 2 h, selon le volume de solvant. Ensuite, le résidu a été reconstitué dans 50 µL de MeOH/ACN (70:30 v/v), contenant 0,01 µg/mL de bisoprolol-d5 et de telmisartan-d7, ainsi que 10 µg/mL d'hydrochlorothiazide et de furosémide (solution de pointe 3). L'extrait reconstitué a été vortexé pendant 10 s et chaque échantillon a été transféré dans une entrée d'échantillonneur automatique. Des volumes de 5 µL de chaque échantillon ont été regroupés et utilisés comme échantillon QC. Les échantillons ont été conservés sur de la neige carbonique pour le transport entre les installations et stockés à - 80 ° C jusqu'à l'analyse.

L'analyse LC-HRMS/MS a été effectuée sur la base de publications précédentes36,38 et des détails sur l'instrumentation peuvent être trouvés dans le matériel supplémentaire. En bref, l'appareil utilisé consistait en une pompe Thermo Fisher Scientific Dionex UltiMate 3000 RS, comprenant un dégazeur, une pompe quaternaire et un échantillonneur automatique UltiMate, couplé à un TF Q-Exactive Plus (TF, Dreieich, Allemagne). La source d'ions était une source HESI-II d'ionisation par électropulvérisation chauffée. Les paramètres de la source HESI-II ont été choisis selon une méthode antérieure36.

La chromatographie en phase inversée (RP) a été réalisée sur une colonne TF Accucore Phenyl-Hexyl (100 mm × 2,1 mm, 2,6 μm, TF, Dreieich, Allemagne) et la chromatographie liquide à interaction hydrophile (HILIC) à l'aide d'une colonne Nucleodur (125 mm × 3 mm, 3 μm, Macherey-Nagel, Düren, Allemagne).

Les fichiers bruts TF ont été analysés à l'aide du logiciel TF Xcalibur version 4.1 pour le temps de rétention, l'intensité du pic et la forme du pic pour tous les IS et MoInt afin d'assurer une détection, une identification et une éventuelle saturation du détecteur correctes. Ensuite, les fichiers bruts ont été convertis en fichiers mzXML à l'aide de ProteoWizard39. La sélection des pics a été effectuée à l'aide de XCMS dans un environnement R40. De plus, les pics détectés ont été annotés en tant qu'isotopes, adduits et artefacts à l'aide du package CAMERA41. L'optimisation des paramètres XCMS a été effectuée sur la base d'une méthode précédemment publiée42. Les paramètres optimisés de sélection et d'alignement des pics peuvent être trouvés dans le tableau S2. Après la sélection des pics et le regroupement des échantillons en caractéristiques individuelles, les zones de caractéristiques ont été corrigées par lots à l'aide de la mesure répétée des échantillons QC regroupés43.

Le nombre de caractéristiques a été déterminé et analysé à l'aide d'une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) et du test t à deux échantillons de Welch basé sur une méthode publiée précédemment42 utilisant XCMS, comparant l'extraction II, III et IV contre I, III contre III_B et IV contre IV_B respectivement.

Sur la base des aires de pic des étalons internes (IS) et MoInt, extraites du script d'évaluation, les valeurs de moyenne, d'écart type et de CV ont été calculées à l'aide d'Excel et des diagrammes ont été construits à l'aide de GraphPad PRISM 9. études abolomiques19, ainsi que dans des expériences préliminaires.

L'ANOVA a été appliquée à l'ensemble des données générées pour déterminer des molécules ou des caractéristiques significativement différentes entre les six groupes d'échantillons différents, en utilisant la correction de Bonferroni44 pour corriger les résultats faussement positifs. Pour étudier les différences de groupe entre les méthodes d'extraction, une analyse de la fonction discriminante en composantes principales (PC-DFA) a été réalisée à l'aide des caractéristiques significatives. Avant l'analyse en composantes principales, l'ensemble de données était centré et l'analyse discriminante ultérieure utilisait les composantes qui remplissaient le critère de Kaiser avec un minimum de deux composantes. La qualité de la prédiction a été déterminée à l'aide de la validation croisée de Monte Carlo45.

Les fichiers de données brutes sont téléchargés sur MetaboLights (https://www.ebi.ac.uk/metabolights/) avec l'identifiant d'étude MTBLS6046. Le script d'évaluation pour le prétraitement des données et l'analyse statistique dans R se trouve sur Github (https://github.com/PhilSchip/zebrafish_extraction).

Le MoInt comprenait 59 molécules, principalement des métabolites hôtes qui ont été trouvés significativement modifiés dans les modèles d'infection mycobactérienne utilisant le poisson zèbre et d'autres espèces, ainsi que des métabolites provenant d'expériences d'infection préliminaires réalisées avant cette étude sous la forme d'une approche pseudo-ciblée. Les métabolites d'une étude supplémentaire non liée à la recherche sur les infections37 ont été inclus, en raison de l'adaptation de la méthode d'extraction dans cet article.

Sur la base du m / z et du temps de rétention, une surveillance parallèle de la réaction a été effectuée avec l'échantillon QC regroupé pour identifier le MoInt avec un niveau d'identification de 2 en tant que composés putativement annotés au lieu d'être classés comme composés inconnus, en utilisant un système de classification proposé par Sumner46. Les fichiers de données ont été convertis au format mzXML à l'aide de ProteoWizard39 et importés dans NIST MS Search 2.3. Trois bases de données différentes ont été utilisées pour l'identification des composés : la base de données du métabolome humain (hmdb), le NIST14 (sous-bases de données nist_msms et nist_msms2) et la base de données de spectre de masse Wiley METLIN (sous-bases de données metlin_insilico et metlin_experimental). Les paramètres suivants, basés sur une publication précédente36, ont été utilisés pour la recherche en bibliothèque : type de recherche spectrale, identité (MS/MS) ; ion précurseur m/z, dans le spectre ; pré-recherche, désactivé. Les paramètres MS/MS étaient les suivants : réglages : tolérance précurseur, ± 5 ppm ; tolérance aux ions produits, ± 10 ppm.

Pour déterminer la pertinence biologique des molécules d'intérêt détectées, une analyse des voies à l'aide de la version 5.0 de Metaboanalyst47 a été effectuée. Les identifiants HMDB de chaque MoInt ont été utilisés comme identifiants, connectés à leurs identifiants KEGG correspondants et analysés par rapport à la bibliothèque de voies Danio Rerio de KEGG48,47,50. Avec le 3-cétocholestérol sans HMDB ID et la 3-méthoxytyrosine, le stéaroyl éthanolamide et la diméthylarginine sans KEGG ID, 31 pourraient être utilisés pour cette analyse. L'analyse a été réalisée à l'aide d'un nuage de points comme méthode de visualisation, d'un test hypergéométrique comme méthode d'enrichissement, d'une centralité relative entre les deux pour l'analyse de la topologie, ainsi que de l'utilisation de tous les composés de la bibliothèque de voies comme métabolome de référence.

Les quatre méthodes d'extraction différentes ont d'abord été analysées sur la base du nombre de caractéristiques. Bien que le nombre de caractéristiques en tant que paramètre de qualité analysé soit moins pertinent dans les approches ciblées, il peut être un substitut utile pour la métabolomique non ciblée. Bien que cela n'affecte pas les résultats de l'approche pseudo-ciblée, il est mieux corrélé à la couverture de l'ensemble du métabolome et offre ainsi une plus grande chance de détecter les métabolites recherchés mais non ciblés. Comme le montre la figure 3, les extractions I et II ont permis la détection de plus de caractéristiques, par rapport aux méthodes à deux phases III et IV. En raison de la perte de métabolites lipophiles lors de la séparation de phase, cette observation était attendue et pourrait être contournée en utilisant une méthode dédiée aux substances lipophiles sur l'extrait lipophile rejeté. La seule exception était l'analyse sur la colonne Phenyl-Hexyl utilisant le mode d'ionisation positive, où II, III et IV étaient tous augmentés. Pour les extractions II et IV l'ultra-sonification et donc une plus grande homogénéisation des échantillons pourraient expliquer cet effet, ce qui n'est pas vrai pour l'extraction III. En regardant les autres essais, aucun effet de l'ultra-sonification n'a pu être observé. Aucune explication n'est donc possible pour l'instant.

Nombre de fonctionnalités détectées. L'évaluation statistique a été effectuée à l'aide de l'ANOVA unidirectionnelle et du test t à deux échantillons de Welch comparant chaque groupe à l'extraction I. (A) Colonne phényl-hexyle, ionisation positive. (B) Colonne phényl-hexyle, ionisation négative. (C) Colonne HILIC, ionisation positive. (D) Colonne HILIC, ionisation négative. ns non significatif ; *p < 0,05 ; **p < 0,01 ; ***p < 0,001 ; ****p < 0,0001. n = 5 pour chaque groupe d'échantillons.

Hormis cette exception, les extractions I et II ont montré un nombre de caractéristiques très similaire, tandis que les méthodes III et IV différaient en fonction de la polarité de l'analyse. L'extraction IV a montré un nombre de caractéristiques plus élevé après ionisation positive (A et C) et l'extraction III après ionisation négative (B et D), respectivement.

En général, le mode d'ionisation positive a permis la détection de plus de caractéristiques que le mode d'ionisation négative, avec environ 2200 à 6000 caractéristiques contre environ 600 à 1300 caractéristiques, respectivement. Il a également été observé que l'analyse après l'utilisation de la colonne HILIC montrait moins de la moitié des caractéristiques que l'analyse après l'utilisation de la colonne Phenyl-Hexyl.

L'utilisation d'un prétraitement mécanique a entraîné une augmentation significative du nombre de caractéristiques (Fig. 4) dans toutes les analyses effectuées. Cela indique l'homogénéisation réussie des échantillons, ce qui conduit à plus de tissus de larves en panne et à plus de métabolites, libérés pour l'extraction.

Sur la base de ces résultats, les méthodes à deux phases ont manqué des caractéristiques, probablement en raison de la séparation des substances hydrophiles et lipophiles et de l'élimination ultérieure de ces substances lipophiles. Alors que les extraits eux-mêmes devraient contenir moins de molécules interférentes, la possibilité de manquer des caractéristiques pertinentes est problématique. Pour l'utilisation de l'homogénéisation des billes, le contraire a été démontré. Un nombre de caractéristiques plus élevé, égal ou supérieur dans certains cas aux extractions à une phase, a conduit à une meilleure couverture, avec un risque plus élevé de molécules interférentes.

Les deux résultats doivent néanmoins être traités avec prudence. Les signaux dérivés de manière endogène, par exemple résultant d'isotopes, de la formation d'adduits ou de la fragmentation, ainsi que les signaux artificiels provenant de contaminants, de bruit ou d'erreurs dans le traitement des données51 peuvent entraîner une variation significative du nombre de caractéristiques mesurées.

Cependant, dans cette étude, la faible variabilité dans chaque groupe d'échantillons, ainsi que la compensation des signaux erronés aléatoires par cinq extractions répétées par groupe, conduisent à une grande confiance dans ces résultats. Bien que ces variations puissent encore jouer un rôle dans les différences observées, leur rôle majeur semble peu probable.

Ces résultats indiquent des différences entre chaque principe d'extraction, tandis que les méthodes utilisant le même principe montrent des résultats beaucoup plus proches pour toutes les caractéristiques, comme prévu. Si ces différences sont pertinentes pour le futur modèle d'infection ou n'ont d'impact que sur des molécules non pertinentes pour l'étude de l'infection à M. marinum, on ne sait pas pour l'instant. Pour mieux évaluer les différences et leur pertinence, les standards internes et MoInt, sélectionnés en fonction du contexte scientifique d'une future application de la procédure d'extraction pour un modèle d'infection à M. marinum, ont été analysés dans les étapes suivantes.

Les étalons internes utilisés peuvent être divisés en trois groupes distincts en fonction de leur ajout au début de l'extraction (spike 1), avant l'évaporation (spike 2) ou pendant la reconstitution (spike 3). Leur succès de pic de sélection en fonction de la colonne utilisée et de l'ionisation ainsi que leur temps de rétention et m/z peuvent être trouvés dans le tableau S1. Remarquable est le fait que le tryptophane-d5 et le glucose-d7 n'ont pas été détectés en utilisant la colonne HILIC et le mode d'ionisation négative, probablement en raison de très faibles intensités, et dans le cas du glucose-d7 en plus, en raison d'une forme de pic inhabituellement large. Les intensités plus faibles de l'IS après ionisation négative, en particulier après HILIC, ne pouvaient être contournées. La forme du pic de glucose-d7 après HILIC a indiqué la nécessité d'une optimisation de la chromatographie, ce qui n'a pas été fait dans le cadre de cette étude en raison de la faible pertinence des saccharides dans le MoInt, ainsi que de la qualité de détection suffisante après chromatographie RP.

Les aires des pics de chaque étalon interne détecté ont été normalisées sur l'aire moyenne des pics à l'aide de l'extraction I, utilisée comme étalon de référence en raison du fait qu'il s'agit d'une méthode déjà établie. Ces aires de pic normalisées peuvent être trouvées dans les Fig. S2–S5. Les valeurs CV respectives peuvent être trouvées dans les Fig. S6–S9. De plus, les deux tests t de Welch ont été effectués, comparant les zones de pic des extractions II, III et IV avec l'extraction I. Les différences significatives qui en résultent sont résumées dans les tableaux S3 à S6.

Les aires des pics de tryptophane-d5 étaient très similaires entre les méthodes d'extraction, à l'exception de l'extraction IV, qui a montré une diminution notable dans les trois analyses.

Le glucose-d7 n'a pu être détecté qu'en utilisant la colonne Phenyl-Hexyl et le mode d'ionisation négative, et des aires de pics très similaires, à l'exception d'une augmentation pour l'extraction II, ont été observées.

L'acide palmitique-d31 a montré une différence significative entre les méthodes à une phase et à deux phases. Très probablement en raison de sa haute lipophilie en tant qu'acide gras à longue chaîne, la récupération à l'aide de méthodes à deux phases était presque inexistante, tandis que les extractions I et II étaient également capables d'extraire l'acide palmitique-d31.

En utilisant l'ionisation négative, à l'exception des aires de pic inférieures pour le glibenclamide sur la colonne HILIC pour l'extraction II, III et IV, les aires de pic des six autres étalons internes testés des pointes 2 et 3 étaient très similaires entre les extractions. Pour l'ionisation positive, cependant, la tendance a été observée pour le glibenclamide et la trimipramine-d3 sur la colonne Phenyl-Hexyl et pour le même IS, ainsi que pour le bisoprolol-d5 et le telmisartan-d7, l'extraction IV ayant les aires de pic observées les plus basses. Ces IS ont été ajoutés juste avant l'évaporation et la reconstitution, ces différences ne peuvent provenir qu'à partir de ce point. Outre les interférences d'autres molécules, la plus longue durée d'évaporation sous vide pourrait être un facteur de perte d'intensité. En revanche, le même effet a été observé pour le bisoprolol-d5 et le telmisartan-d7 contenus dans la solution de pointe 3, qui ont été ajoutés dans la solution de reconstitution, mais uniquement avant l'analyse basée sur HILIC. Par conséquent, l'interaction de ces IS avec d'autres molécules au cours de la course LC ou l'adhérence aux flacons en verre brun non silanisés utilisés étaient plus probables.

Concernant les CV, la majorité se situent entre 5 et 20%. Les exceptions incluent l'acide palmitique-d31 pour les extractions en deux phases en raison des zones de pic très faibles, le glucose-d7 pour l'extraction IV, ainsi que le glibenclamide sur la colonne HILIC et le bisoprolol-d5, en utilisant l'extraction II.

Dans l'ensemble, toutes les méthodes d'extraction ont montré des valeurs de CV relativement faibles, l'extraction II ayant la pire précision et l'extraction III étant préférée à l'extraction IV basée sur la récupération du tryptophane-d5.

Outre une augmentation significative des aires des pics de furosémide (ionisation négative, colonne Phenyl-Hexyl), aucun changement significatif des aires des pics de l'IS n'a pu être observé. Le prétraitement mécanique a entraîné une augmentation des CV pour le tryptophane-d5 dans tous les domaines, à l'exception de l'extraction IV_B sur la colonne HILIC (ionisation positive), qui a montré une réduction d'environ 2 % de points, tandis que le glucose-d7 a montré une augmentation en utilisant la méthode III et une diminution en utilisant la méthode IV dans le même ordre de grandeur.

Pour évaluer davantage les différences entre les méthodes d'extraction qui pourraient être pertinentes pour le problème analytique choisi, une bibliothèque complète de MoInt a été utilisée. Au total, 59 MoInt ont été sélectionnés pour évaluation, sur la base de la littérature et d'expériences internes préliminaires, qui peuvent être trouvées dans le tableau S7. Après détection et évaluation manuelle des pics résultants, 34 et 16 molécules de cette liste sont restées, en utilisant respectivement l'ionisation positive et négative. Les plages d'étalonnage sont généralement testées au préalable pour des approches quantitatives et ciblées afin d'assurer l'analyse des molécules cibles dans la plage dynamique d'une courbe concentration-réponse. Cette approche n'est pas réalisable pour les approches non ciblées, en raison du large éventail de cibles possibles et inconnues. Cette étude et les autres études d'infection prévues utilisent une approche qualitative, comparant uniquement les quantités relatives de MoInt entre différents groupes d'échantillons sans quantifier la concentration des molécules cibles. Néanmoins, la saturation du détecteur peut être un problème même dans les études non ciblées et qualitatives. Pour évaluer cet effet dans le contexte de l'étude actuelle, les formes et intensités des pics de tous les MoInt et IS ont été analysées manuellement à l'aide du logiciel TF Xcalibur. Les signaux ont été évalués pour détecter des signes de saturation, tels que des formes de pic irrégulières et aplaties, ou des intensités de signal particulièrement élevées. Aucun de ces effets n'a été observé dans les données de cette étude. Les données résultantes doivent donc être considérées comme robustes, en ce qui concerne le MoInt et l'IS analysés, alors qu'il faut reconnaître que pour les futures études métabolomiques non ciblées, les effets de saturation doivent être exclus par des expériences de dilution supplémentaires et des expériences avec des quantités plus élevées de substrat (dans ce cas, les larves de poisson zèbre).

La liste de ces MoInt détectés avec succès, leur sous-groupe de composés, ainsi que leur détection sur chaque colonne, les paramètres d'inclusion et l'état d'identification basé sur les spectres générés lors des analyses PRM de suivi de l'échantillon QC regroupé, se trouve dans le tableau 1 pour le mode d'ionisation positive et le tableau 2 pour le mode d'ionisation négative.

Comme les aires des pics des étalons internes (voir Section 3.1.2), les aires des pics de chaque MoInt détecté ont été normalisées sur l'aire moyenne des pics d'extraction I et les moyennes pour chaque extraction, ainsi que leurs écarts-types, peuvent être trouvés dans les Figs. S10–S13. Les résultats du test t à deux échantillons de Welch, comparant les extractions II, III et IV à l'extraction I, se trouvent dans les tableaux S8 à S11.

Dans les quatre analyses, la plupart des MoInt ont été détectés avec des aires de pic à peu près égales à celles de l'extraction I, en particulier pour l'extraction II, étant la méthode la plus étroitement liée à l'extraction I. L'utilisation de méthodes d'extraction à deux phases a conduit à une réduction significative des aires de pic pour quelques MoInt, notamment le 3-cétocholestérol, la N-palmitoyl-d-sphingosine et l'acide inosinique. En revanche, une large gamme de molécules, en particulier les acides aminés, ont été augmentées de manière significative. Alors que la récupération inférieure peut être expliquée en fonction de la lipophilicité du MoInt affecté, l'augmentation des zones de pic pour les acides aminés pourrait être attribuée à plusieurs facteurs, par exemple, une récupération globale plus élevée, un nombre plus élevé de signaux interférents pour des valeurs m/z et de temps de rétention similaires, ou des quantités inférieures de molécules, interférant avec l'ionisation du MoInt.

En particulier, un nombre plus élevé de molécules interférentes pourrait jouer un rôle important lors de l'utilisation de la colonne Phenyl-Hexyl, car la plupart des acides aminés éluent très tôt dans les 60 premières secondes.

En résumé, les extractions à deux phases semblaient avoir l'avantage d'une récupération MoInt plus élevée, les deux méthodes III et IV montrant des résultats très similaires. En ce qui concerne les extractions monophasiques, l'extraction I semble être la plus prometteuse, en ce qui concerne la récupération des caractéristiques. La synthèse de ces résultats pour tous les MoInt pour chaque extraction (Fig. 5) a montré les méthodes à phase unique avec des aires de pic globalement beaucoup plus faibles, l'extraction II montrant la récupération la plus faible, sauf sur la colonne Phenyl-Hexyl utilisant l'ionisation négative. Les extractions III et IV ont montré des résultats très similaires. En regardant l'extraction de l'écart type, j'ai montré la précision la plus élevée, tandis que l'extraction II avait une précision inférieure dans tous les domaines, et les deux méthodes à deux phases ont montré les écarts types les plus élevés et la précision la plus faible, à l'exception de l'extraction II sur la colonne Phenyl-Hexyl et de l'ionisation positive.

Moyenne des aires de pic normalisées de chaque procédure d'extraction et leur écart type respectif. n = 5 pour chaque groupe d'échantillons. (A) Colonne phényl-hexyle, ionisation positive. (B) Colonne phényl-hexyle, ionisation négative. (C) Colonne HILIC, ionisation positive. (D) Colonne HILIC, ionisation négative.

Pour visualiser la précision de chaque MoInt individuel, les valeurs de CV respectives sont présentées dans les Fig. S14–S17. La plupart des CV se situaient entre 5 et 25 %. L'utilisation de l'ionisation positive conduit à des résultats plus précis, par rapport à l'ionisation négative, au moins en partie en raison des intensités globales plus faibles pour la plupart des analytes dans les analyses négatives, en particulier celles détectées par ionisation positive et négative. L'extraction II a montré en moyenne les valeurs de CV les plus élevées et le plus de molécules avec des déviations très élevées, tandis que les extractions III et IV ont montré des valeurs de CV pour la plupart égales ou légèrement supérieures à celles de l'extraction I. Certaines des valeurs de CV les plus élevées ont en outre été influencées par la récupération plus faible mentionnée précédemment des molécules lipophiles. L'extraction I a montré les résultats les plus précis pour les extractions monophasées, tandis que l'extraction III a montré un CV légèrement inférieur pour l'ionisation négative et l'extraction IV pour l'ionisation positive, respectivement.

Les aires des pics des extractions III et IV comparées à leurs homologues avec un prétraitement ajouté (extractions III_B et IV_B) peuvent être trouvées dans les Figs. S18–S21 du matériel supplémentaire. Résumées à la Fig. 6, les deux extractions avec prétraitement ont montré en moyenne une augmentation des zones de pic MoInt. L'extraction III_B a montré des aires de pic plus élevées pour l'ionisation négative et des aires de pic similaires ou légèrement inférieures pour l'ionisation positive par rapport à IV_B. Les zones de pic plus élevées étaient accompagnées d'écarts-types plus élevés ou à peu près égaux. Les CV des MoInt individuels n'ont montré aucune tendance claire (Figs. S22–S25). L'extraction IV_B a conduit à des CV plus élevés que III_B, et en moyenne, les CV étaient similaires entre les extractions respectives avec ou sans prétraitement mécanique. En résumé, l'homogénéisation des billes a augmenté la récupération de MoInt tout en gardant l'égal exact de son homologue sans homogénéisation ajoutée.

Sur les 35 MoInt détectés dans cette étude, 31 ont pu être trouvés dans la base de données KEGG tandis que le kétocholestérol MoInt, la 3-méthoxytyrosine, le stéaroyl éthanolamide et la diméthylarginine manquaient très probablement au fait qu'il s'agissait de métabolites assez inexplorés. Le 3-cétocholestérol et le stéaroyl éthanolamide proviennent d'expériences internes préliminaires et ne sont donc que provisoirement liés à l'infection par mycobacterium marinum dans ZF, tandis que la 3-méthoxytyrosine et la diméthylarginine ont été liées à une infection mycobactérienne dans ZF dans une autre étude20.

Le résumé de l'analyse des voies pour les MoInts se trouve à la Fig. 7. Au total, 33 voies ont été trouvées, la plupart d'entre elles étant liées au métabolisme de molécules spécifiques, par exemple le métabolisme du tryptophane, de la biotine ou de la phénylalanine. Un aperçu de toutes les voies peut être trouvé dans le tableau S12. Sur ces 33 voies, neuf ont montré une valeur p de 0,01 ou moins, indiquant des corrélations robustes de MoInt et des voies. La biosynthèse d'aminoacyl-ARNt a montré la plus grande quantité de MoInt corrélé. Ceci est entièrement basé sur le fait que le groupe d'acides aminés est le plus grand groupe de MoInt détecté et donc en tant que précurseurs de la partie biosynthèse de l'aminoacyl-ARNt de cette voie. Cependant, le score d'impact associé avec 0,00 était très faible. Beaucoup plus pertinentes sont les trajectoires combinant une valeur d'impact élevée et des valeurs de p faibles. Ces voies étaient la biosynthèse de l'arginine et la dégradation de la lysine montrant les valeurs p les plus faibles après la biosynthèse de l'ARNt et un impact modéré, tandis que la biosynthèse de la phénylalanine, de la tyrosine et du tryptophane, ainsi que le métabolisme de l'alanine, de l'aspartate et du glutamate ont montré les valeurs d'impact les plus élevées et sont donc plus susceptibles d'être connectées et pertinentes pour d'autres voies et le métabolisme dans son ensemble.

Résumé de l'analyse des voies de tous les MoInt détectés, identifiant les voies les plus pertinentes en fonction de leur impact et des valeurs p ajustées. L'impact de la voie a été calculé comme une combinaison de la centralité et de l'enrichissement de la voie, la valeur d'impact étant positivement corrélée à l'importance relative d'une voie. Les couleurs des cercles indiquent l'importance (augmentant du blanc au rouge) et la taille des cercles l'impact sur la voie. Les résultats ont été générés à l'aide de Metaboanalyst version 5.0.

En résumé, le MoInt détecté et analysé dans cette étude pourrait être connecté à plusieurs voies d'impact variable et, en combinaison avec des corrélations prouvées avec des infections mycobactériennes pour la plupart d'entre elles, le MoInt sélectionné pourrait être utile pour de futures études d'infection couvrant une variété de différentes voies métaboliques.

Les métabolomes entiers détectés dans chaque procédure d'extraction ont été analysés à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle. Les caractéristiques qui montraient une différence significative entre deux groupes quelconques ont été conservées pour les statistiques multivariées. Avec 3016 et 638 caractéristiques significativement différentes après analyse, en utilisant la colonne Phenyl-Hexyl, ainsi que 713 et 202 après analyse en utilisant la colonne HILIC pour l'ionisation positive et négative, respectivement. En comparant ces chiffres au nombre total de caractéristiques discuté précédemment, environ 50 % de toutes les caractéristiques étaient significatives sur la colonne Phenyl-Hexyl et environ 30 % sur la colonne HILIC. Cela indique que la colonne Phényl-Hexyle est plus affectée par les changements apportés à la procédure d'extraction. Deux effets possibles pourraient jouer un rôle dans ce phénomène. Premièrement, une détectabilité différente des molécules, basée sur la séparation sur les différentes colonnes, conduisant à plus de molécules non affectées par l'extraction détectées sur la colonne HILIC ou vice versa. Deuxièmement, les interactions entre différentes molécules, par exemple, l'extinction de l'ionisation ou des signaux interférents, qui seraient particulièrement pertinentes dans la première minute sur la colonne Phenyl-Hexyl. La plupart des acides aminés du MoInt, ainsi que de nombreuses molécules détectées ont été détectées dans cette fenêtre, augmentant la possibilité de ces interactions et augmentant la variabilité d'une pléthore de molécules. Alors qu'un nombre similaire de molécules pourraient être directement affectées par le processus d'extraction, leur co-élution sur la colonne Phenyl-Hexyl pourrait augmenter leur effet sur le métabolome détecté.

Le PC-DFA suivant dans les Fig. 8 et 9 ont montré une bonne séparation entre les extractions monophasiques (I et II), les extractions biphasiques (III et IV) et les extractions biphasiques avec prétraitement mécanique (III_B et IV_B). La seule exception a été trouvée pour la colonne Phényl-Hexyle et l'ionisation positive, III_B et IV étant très similaires. Cela pourrait indiquer un effet similaire de l'homogénéisation des billes de III_B et de l'ultra-sonification de IV, mais cela n'est pas étayé par les autres résultats.

PC-DFA utilisant des caractéristiques significatives identifiées par ANOVA unidirectionnelle. (A) Colonne phényl-hexyle, mode d'ionisation positive. (B) Colonne phényl-hexyle, mode d'ionisation négative. Le nombre de composantes principales utilisées, la précision de la prédiction et le κ de Cohen sont fournis. n = 5 pour chaque groupe d'échantillons. Les fonctions discriminantes (DF1 et DF2) pour maximiser la distance entre les classes et minimiser la distance au sein de la classe ont été tracées respectivement sur les axes x et y. L'addition de l'homogénéisation des billes a été notée "_B".

PC-DFA utilisant des caractéristiques significatives identifiées par ANOVA unidirectionnelle. (A) Colonne HILIC, ionisation positive. (B) Colonne HILIC, ionisation négative. Le nombre de composantes principales utilisées, la précision de la prédiction et le κ de Cohen sont fournis. n = 5 pour chaque groupe d'échantillons. Les fonctions discriminantes (DF1 et DF2) pour maximiser la distance entre les classes et minimiser la distance au sein de la classe ont été tracées respectivement sur les axes x et y. L'addition de l'homogénéisation des billes a été notée "_B".

Alors que les extractions I et II, ainsi que III_B et IV_B étaient clairement séparées dans toutes les analyses, les extractions III et IV n'étaient pas clairement séparées pour la colonne HILIC, indiquant une couverture très similaire du métabolome et donc aucun effet significatif des différences d'extraction entre les deux méthodes. L'ajout d'un prétraitement mécanique ajoute également la séparation, de sorte qu'aucun effet cohérent n'a pu être observé.

En résumé, outre l'exception mentionnée précédemment, les six extractions ont montré une couverture différente de l'ensemble du métabolome, ce qui indique que les différences dans les procédures d'extraction ont un poids différent. La séparation des phases et l'homogénéisation des billes semblaient modifier l'extraction de manière beaucoup plus drastique que les variations d'autres facteurs tels que les solvants d'extraction, le temps d'incubation ou l'ajout d'ultra-sonification.

Plusieurs différences ont pu être observées parmi les sous-groupes testés (tableau 3). Les extractions en deux phases sans homogénéisation des billes ont montré le nombre de caractéristiques le plus bas, les deux autres groupes ayant des nombres similaires. L'extraction II a eu la récupération la plus faible dans cette étude, suivie de l'extraction I. Les deux extractions à deux phases ont eu des taux de récupération plus élevés, encore augmentés par l'homogénéisation des billes. Les valeurs de CV les plus basses et donc les meilleures précisions ont été trouvées pour l'extraction I, les deux extractions à deux phases montrant en moyenne des CV légèrement plus élevés, encore augmentés après l'homogénéisation des billes. Différentes extractions ont été comparées dans cette étude. Les extractions en une phase conduisent à la détection de plus de caractéristiques dans l'ensemble et les zones de caractéristiques de MoInt étaient plus faibles dans la plupart des cas par rapport aux extractions III et IV, en particulier en ce qui concerne les acides aminés. Seuls quelques MoInt, ainsi que l'acide palmitique-d31, ont été réduits, probablement en raison de leur lipophilie et de l'élimination qui en résulte dans la partition lipophile du chloroforme dans les extractions en deux phases. Les CV de MoInt étaient plus faibles pour les méthodes à une phase, en particulier l'extraction I, indiquant une meilleure précision et reproductibilité globales. Une homogénéisation supplémentaire des larves à l'aide de billes de verre a augmenté le nombre de caractéristiques et la récupération de MoInt, tout en diminuant légèrement la précision. Ainsi, l'homogénéisation des billes pourrait être une optimisation possible à l'avenir si les avantages d'une récupération et d'un nombre de caractéristiques plus élevés l'emportent sur les résultats plus imprécis. En résumé, l'extraction I devrait être préférée à l'extraction II, basée sur des zones de pic globales plus élevées de MoInt, des CV inférieurs de ces zones de pic et des nombres de caractéristiques similaires, ainsi qu'un processus expérimental plus facile. Les extractions III et IV ont montré des aires de pic et des CV similaires pour MoInt, mais l'extraction III a montré un nombre de caractéristiques plus élevé, lors de l'utilisation de l'ionisation négative, un processus expérimental plus facile et une aire de pic plus élevée pour le tryptophane-d5.

D'autres expériences impliquant le modèle d'infection lui-même doivent être réalisées, et les deux méthodes I et III, montrant les meilleurs résultats dans cette étude, doivent être comparées plus en détail. Pour un ensemble de données plus robuste augmentant le nombre d'échantillons utilisés, des expériences répétées, ainsi que l'éventuelle inclusion d'autres normes internes et de MoInt supplémentaires pourraient être ajoutés.

Toutes les données générées pendant et/ou analysées pendant l'étude en cours ne sont pas accessibles au public, mais sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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L'auteur tient à remercier Felix Deschner, Verena Quallaku, Armin A. Weber, Matthias J. Richter, Tanja M. Gampfer, Cathy M. Jacobs, Juel M. Schaar et Carsten Schröder pour leur soutien et/ou discussion utile et l'initiative HIPS-UdS TANDEM pour leur soutien.

Financement Open Access activé et organisé par Projekt DEAL.

Département de toxicologie expérimentale et clinique, Centre de signalisation moléculaire (PZMS), Institut de pharmacologie et de toxicologie expérimentales et cliniques, Université de la Sarre, 66421, Homburg, Allemagne

Philip Schippers, Lea Wagmann, Selina Hemmer, Sascha K. Manier et Markus R. Meyer

Institut Helmholtz pour la recherche pharmaceutique de la Sarre (HIPS), Centre Helmholtz pour la recherche sur les infections (HZI), Université de la Sarre, Sarrebruck, Allemagne

Philip Schippers, Sari Rasheed, You Me Park, Timo Risch, Rolf Muller et Jennifer Herrmann

Centre allemand de recherche sur les infections (DZIF), site partenaire de Hanovre, Braunschweig, Allemagne

Sari Rasheed, Timo Risch, Rolf Muller et Jennifer Herrmann

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PS, SR, SH, SKM, RM, JH, MRM ont conçu l'expérience ; PS, SR, YMP, TR ont réalisé les expériences ; PS, SR, LW, SH, SKM, JH, MRM ont analysé et interprété les données ; PS, RM, JH, MRM ont écrit et édité le manuscrit ; PS a préparé les chiffres; LW, SH, SKM ont révisé le manuscrit.

Correspondance à Markus R. Meyer.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Schippers, P., Rasheed, S., Park, YM et al. Évaluation des méthodes d'extraction pour des études métabolomiques non ciblées pour de futures applications dans des modèles d'infection de larves de poisson zèbre. Sci Rep 13, 7489 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34593-y

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Reçu : 06 février 2023

Accepté : 04 mai 2023

Publié: 09 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-34593-y

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