Complexité inattendue de l'ammoniaque monooxygénase chez les archées

The ISME Journal volume 17, pages 588–599 (2023)Citer cet article

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L'oxydation de l'ammoniac, première étape de la nitrification, constitue un processus critique du cycle global de l'azote. Cependant, les connaissances fondamentales sur son enzyme clé, la monooxygénase d'ammoniac dépendante du cuivre, font défaut, en particulier pour les archées oxydantes d'ammoniac (AOA) abondantes dans l'environnement. Ici, la structure de l'enzyme est étudiée par électrophorèse sur gel natif bleu et protéomique à partir de complexes membranaires natifs de deux AOA. Outre les sous-unités AmoABC connues et l'AmoX précédemment prédit, deux nouvelles sous-unités protéiques, AmoY et AmoZ, ont été identifiées. Ils sont uniques à l'AOA, hautement conservés et co-régulés, et leurs gènes sont liés à d'autres gènes de sous-unité AMO dans des génomes AOA rationalisés. La modélisation et les approches de réticulation dans le gel soutiennent une structure globale de protomère similaire à la méthane monooxygénase bactérienne particulaire éloignée mais révèle également des différences claires dans les domaines extracellulaires de l'enzyme. Ces données ouvrent la voie à d'autres études structure-fonction de ce complexe de nitrification écologiquement important.

La nitrification, la conversion de l'ammonium en nitrate, est une étape cruciale du cycle global de l'azote uniquement réalisée par des micro-organismes. Le processus a attiré une attention particulière en raison de sa pertinence agricole et environnementale. La première étape de la nitrification, qui limite la vitesse [1], est l'oxydation de l'ammoniac via le complexe protéique membranaire intégral ammoniac monooxygénase (AMO) [2, 3]. Alors que les bactéries oxydant l'ammoniac (AOB) ont été découvertes pour la première fois il y a plus de 125 ans [4] et ont été largement étudiées, ce processus biologique a également été détecté dans le domaine archéen au cours des 20 dernières années [5,6,7]. Les archées oxydant l'ammoniac (AOA) ont suscité une large attention car elles sont répandues dans la nature et sont plus abondantes que leurs homologues bactériennes dans la plupart des environnements terrestres et marins, indiquant des rôles importants dans le cycle de l'azote [8,9,10,11,12,13,14]. Leur métabolisme central de l'azote et du carbone est cependant distinct de celui des AOB [15, 16, 17, 18]. En particulier, les sous-unités du complexe AMO ne présentent qu'environ 40% d'identité avec celles des bactéries [19] et les protéines archées catalysant la deuxième étape de l'oxydation de l'ammoniac, c'est-à-dire la conversion de l'hydroxylamine en nitrite, sont encore inconnues [19,20,21]. Ces différences impliquent une différenciation fonctionnelle importante dans leurs rôles environnementaux qui doivent encore être éclaircis.

En raison de la difficulté de cultiver des organismes nitrifiants et des problèmes inhérents à l'isolement des protéines membranaires, aucune étude structurale n'a été menée avec succès pour aucun complexe AMO, bactérien ou archéen. Cela est vrai pour la plupart des diverses enzymes de la famille des protéines CuMMO (monooxygénase membranaire dépendante du cuivre), à quelques exceptions notables près. Les structures cristallines [22, 23, 24, 25, 26] et les structures cryo-EM [27, 28] de la méthane monooxygénase particulaire (pMMO) de cinq méthanotrophes ont systématiquement confirmé un protomère à trois polypeptides (sous-unités-A, -B et -C) disposés dans un trimère de configuration α3β3γ3 avec au moins deux sites métalliques conservés dans chaque protomère. Même ainsi, l'élucidation du site actif est restée ambiguë. Il a d'abord été proposé de résider dans la sous-unité PmoB de pMMO [29]. Plus récemment, une analyse cryo-EM soutient que le site actif est principalement coordonné par PmoA [27], tandis que la conservation différente des acides aminés dans Verrucomicrobia [30], une analyse spectroscopique récente [31] et la mutagenèse d'une monooxygénase hydrocarbonée [32] suggèrent sa localisation dans la sous-unité PmoC.

Bien qu'aucune structure AMO n'ait été déterminée expérimentalement, la modélisation d'homologie pour l'AMO de la bactérie Nitrosomonas europaea en utilisant pMMO comme matrice a soutenu une structure homotrimérique ainsi que la conservation des sites de cuivre CuB et CuC [33]. Le complexe AMO archéen est la plus éloignée de toutes les protéines CuMMO [34, 35] et on en sait très peu à ce jour sur sa structure ou sa fonction. Sur la seule base de la métagénomique comparative, il a été suggéré qu'une sous-unité supplémentaire pourrait être présente dans le complexe, appelée AmoX [15, 36].

Pour mieux comprendre l'architecture globale du complexe archaeal AMO, des fractions de protéines membranaires de l'AOA du sol bien caractérisé, Nitrososphaera viennensis, ont été analysées biochimiquement à l'aide d'une électrophorèse sur gel natif, d'une spectrométrie de masse et d'une réticulation chimique. Outre les trois protéines AmoABC connues, trois sous-unités potentielles supplémentaires ont été identifiées et l'une des six protéines AmoC prédites chez N. viennensis a été reconnue comme l'homologue principal du complexe protéique. De plus, la composition globale des sous-unités du complexe AMO a été confirmée dans l'AOA thermophile éloigné apparenté Nitrosocaldus cavascurensis.

Nitrososphaera viennensis a été cultivé en culture continue dans des bioréacteurs de 2 L (Eppendorf) remplis de 1,5 L de milieu d'eau douce (FWM) [37, 38] avec une solution d'oligo-éléments modifiée [5], 7,5 µM FeNaEDTA, 2 mM NH4Cl et 1 mM pyruvate à 42 ° C et pH 7,5. Le carbonate a été fourni en gazant les réacteurs avec un mélange de 98 % d'air et de 2 % de CO2. Les taux de dilution appliqués variaient de 0,035 à 0,07 h−1.

Nitrosocaldus cavascurensis a été cultivé en culture discontinue dans les mêmes réacteurs, volume et milieu que ceux décrits pour N. viennensis, mais à 68 ° C avec 1 mM de NH4Cl, 1 mM de pyruvate et pH 7,0. Le carbonate était également fourni par gazage, mais avec un mélange air/N2/CO2 pour obtenir un mélange 10 % O2 et 2 % CO2. Pour augmenter la biomasse, NH4Cl a été ajouté par étapes avec des seringues via un septum pour augmenter la concentration finale de NO2− à environ 2,5 mM avant de récolter les cultures.

La biomasse récoltée a été concentrée en trois étapes de centrifugation. D'abord avec une centrifugeuse continue (CEPA modèle LE) fonctionnant à vitesse maximale. La biomasse de la centrifugeuse continue a ensuite été mise en suspension dans des volumes de 400 ml et concentrée à l'aide d'un Sorvall Lynx 4000 avec un rotor F12–6 × 500 pendant 30 min à 4 ° C et 16 000 × g. Enfin, la biomasse a été remise en suspension dans de petits volumes et aliquotée dans des tubes Eppendorf de 1,5 ml et concentrée en un culot final pendant 30 min à 4 ° C et 16 000 × g à l'aide d'une centrifugeuse de paillasse. Les culots ont été congelés à -70 °C jusqu'à une analyse plus approfondie.

Des informations détaillées sur l'analyse bioinformatique, l'extraction des protéines membranaires, les méthodes BN-PAGE, les méthodes Tricine-SDS-PAGE, la préparation de la spectrométrie de masse, la réticulation, l'analyse des données et les prédictions des multimères AlphaFold peuvent être trouvées dans Matériels et méthodes supplémentaires.

En bref, les cellules ont été lysées et les fractions membranaires ont été isolées par ultracentrifugation (ultracentrifugeuse Beckman Coulter; SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor, kmax = 124; 200 000 × g) pendant 90 min à 4 ° C en utilisant des tubes en polypropylène à paroi mince de 13,2 ml avec un niveau de décélération réglé sur 7. Les protéines membranaires ont été extraites à l'aide de n-dodécyl-β-D-maltoside (DDM ; Invitrogen BN2005) et chargé sur un gel BN-PAGE prémoulé de 3 à 12 % (Invitrogen BN1001). Les bandes sélectionnées ont été découpées et analysées par spectrométrie de masse pour l'identification des protéines. Les procédures d'extraction des protéines et d'exécution d'un gel BN-PAGE étaient basées sur des études antérieures [39, 40] et sur le manuel NativePAGE Novex Bis-Tris Gel System de Life Technologies (MAN0000557). La conception et l'analyse de l'étude pour l'extraction membranaire et la BN-PAGE ont été guidées par des études antérieures [41, 42] Les méthodes de réticulation étaient basées sur les protocoles de Hevler et al. (2021) [43].

Les données de protéomique de spectrométrie de masse ont été déposées auprès du Consortium ProteomeXchange via le référentiel partenaire PRIDE [44] avec les identifiants de jeu de données PXD035349, PXD034632 et PXD034475 pour BN-PAGE de N. viennensis, BN-PAGE de N. cavascurensis et des échantillons réticulés, respectivement. Les scripts pertinents pour l'analyse peuvent être trouvés dans le référentiel GitHub https://github.com/hodgskiss/Archaeal_AMO.

Nitrososphaera viennensis a été cultivé en culture continue pendant plusieurs semaines dans des conditions de croissance optimales afin d'obtenir suffisamment de biomasse pour les analyses biochimiques (Melcher et al. [45]). Entre 800 et 2000 µg de protéines membranaires ont été obtenues à partir de 450 à 550 mg de biomasse par préparation, dont environ 40 à 50 µg ont été chargés par ligne sur des gels PAGE natifs bleus [39]. Après optimisation des conditions, 22 bandes ont été découpées et soumises à une spectrométrie de masse (voir Matériels et méthodes supplémentaires ; Fig. S1A). Les sous-unités AMO (AmoA, AmoB et AmoC) figuraient parmi les protéines les plus abondantes (22 % de l'intensité normalisée de l'iBAQ) détectées globalement dans ces fractions membranaires. Les profils d'intensité relative d'AmoA, AmoB et AmoC ont montré trois pics distincts correspondant aux bandes 4, 7 et 12, le pic le plus important se produisant au niveau de la bande 7 (Fig. 1A). Les sous-unités AmoA, AmoB et AmoC représentaient respectivement 10 %, 5 % et 14 % de la protéine totale trouvée dans la bande 7 sur la base des intensités normalisées iBAQ. L'AmoX était également présent dans la bande 7 représentant 10 %. Les signaux les plus intenses pour la sous-unité AmoC étaient représentés par deux des six homologues AmoC, AmoC6 et AmoC4. Ces deux homologues n'ont pas pu être distingués sur la base des peptides identifiés dans le gel BN-PAGE. En dénaturant Tricine-SDS-PAGE des découpes de la bande 7, tous les composants connus du complexe AMO ont été visualisés et confirmés par protéomique (Fig. 2). De plus, cela a permis l'identification de peptides uniques de la sous-unité AmoC6 (voir Discussion supplémentaire).

Abondance relative des intensités normalisées iBAQ des sous-unités AMO connues et putatives. Les intensités iBAQ pour chaque protéine sont normalisées à l'intensité détectée la plus élevée de cette protéine pour créer un profil d'abondance relative pour chaque protéine. A Modèles d'intensité AMO chez N. viennensis. B Modèles d'intensité AMO chez N. cavascurensis. Les bandes sélectionnées pour être coupées et analysées par spectroscopie de masse sont indiquées par des crochets numérotés de gauche (haut du gel) à droite (bas du gel) et correspondent aux nombres sur l'axe des abscisses des parcelles respectives. Les échelles pour chaque gel sont représentées au bas des panneaux respectifs.

Tricine-SDS-PAGE des bandes AMO des gels BN-PAGE. Comparaison de trois méthodes de coloration différentes pour les gels Tricine-SDS-PAGE avec des marqueurs de taille sur le côté gauche. Les bandes coupées pour analyse à partir d'un gel coloré avec SimplyBlue SafeStain et digéré à l'aide de trypsine sont indiquées par des crochets. Les pourcentages représentent le pourcentage d'intensités de protéines normalisées iBAQ pour chaque bande individuelle. Les identifiants de bande sont indiqués entre parenthèses. Les flèches vertes marquées A, B, C et X représentent les hauteurs de bandes attendues pour les sous-unités AMO AmoA, AmoB, AmoC et AmoX, respectivement. Les flèches orange marquées A, B, C et X représentent des bandes équivalentes d'AmoA, AmoB, AmoC et AmoX, respectivement, à partir de gels colorés à l'argent. Un diagramme circulaire de la bande avec la plus grande quantité d'AmoC montre le pourcentage de bandes AmoC provenant d'homologues AmoC distincts.

Pour identifier des protéines supplémentaires qui pourraient faire partie du complexe AMO archéen, une analyse de corrélation a été menée pour trouver des candidats avec un schéma de migration similaire à celui des trois sous-unités primaires AMO AmoA, AmoB et AmoC4/C6. Les modèles des 50 % de protéines les plus abondantes ont été comparés les uns aux autres à l'aide d'une corrélation de Kendall pour déterminer la probabilité de dépendance entre diverses protéines, en mettant l'accent sur les protéines corrélées aux sous-unités AMO connues. Des critères supplémentaires étaient (i) leur présence dans l'AOA entièrement séquencé, et (ii) leur absence dans les espèces qui n'oxydent pas l'ammoniac [46]. Les deux protéines qui répondaient initialement à ces critères étaient la sous-unité putative AMO AmoX et une protéine hypothétique, NVIE_004540 (tableau 1). Les schémas de migration de ces protéines sont visibles sur la figure 1A. Bien que ce processus de sélection impartial ait produit des candidats AMO supplémentaires, une analyse plus approfondie était nécessaire pour vérifier la présence de ces sous-unités nouvellement identifiées et d'autres sous-unités potentielles.

Des analyses antérieures de sous-unités connues au sein des souches de sol, ou de la famille des Nitrososphaeraceae (telle que définie par la Genome Taxonomy Database [47] ; utilisée partout), ont montré un manque général de regroupement spatial de tous les gènes de sous-unités connus antérieurement. Cependant, au sein des familles Nitrosopumilaceae et Nitrosocaldaceae, les gènes des sous-unités canoniques AMO, AmoABC, et de la sous-unité proposée AmoX sont synténiques [36, 48, 49]. Pour étudier la co-localisation de gènes de sous-unités supplémentaires potentiels, le statut synténique et la conservation à travers l'AOA des cinq gènes en amont et en aval du groupe de gènes amo chez les Nitrosocaldaceae et les Nitrosopumilaceae ont été analysés. Parmi ces gènes, 19 ont été conservés dans l'AOA, cinq se trouvant exclusivement dans l'AOA (ensemble de données supplémentaire 2). Les cinq gènes d'intérêt comprenaient deux gènes amo canoniques (amoA et amoB) et les gènes amoX, NVIE_004540 et NVIE_004550. L'absence d'amoC dans les gènes d'intérêt est attribuée à une version tronquée existant dans le génome de "Candidatus Nitrosopumilus koreensis AR1" (probablement en raison de problèmes d'assemblage) qui l'a empêché d'être identifié comme conservé dans tous les AOA. Le gène amoX a déjà été identifié dans des études métagénomiques [15, 36] et NVIE_004540 était déjà un candidat identifié à partir de l'analyse de corrélation BN-PAGE. La protéine conservée supplémentaire, NVIE_004550, a été récemment identifiée et trouvée directement en amont de NVIE_004540, indiquant une co-transcription potentielle. Les deux nouveaux candidats codent pour des polypeptides de 9,6 kDa et 12,8 kDa respectivement, et - comme la sous-unité candidate AmoX - leur structure secondaire prédite est principalement hélicoïdale et leur localisation subcellulaire est transmembranaire. Les deux nouveaux gènes amo candidats NVIE_004540 et NVIE_004550 ont donc été nommés respectivement amoY et amoZ.

Une analyse plus approfondie chez Nitrosocaldaceae, la première lignée divergente dans les reconstructions évolutives de l'AOA [46, 50], a révélé que les gènes des trois sous-unités candidates pour l'AMO (AmoX, AmoY-homolog of NVIE_004540, et AmoZ-homolog of NVIE_004550) se regroupaient spatialement avec les sous-unités canoniques (AmoABC) et étaient synténiques dans Nitrosocald us cavascurensis et Ca. Nitrosocaldus islandicus. Le regroupement spatial des six gènes de sous-unités est également trouvé dans les MAG récemment obtenus [51] au sein du genre Nitrosocaldus. Dans le cas du genre nouvellement proposé Ca. Nitrosothermus [51], les gènes amo étaient répartis sur plusieurs contigs et la synténie n'a pas pu être définitivement déterminée (Fig. 3). De plus, il est déduit que les six gènes amo ont été nouvellement acquis par le dernier ancêtre commun de l'AOA [46].

Gauche : arbre phylogénétique de l'AOA basé sur 32 protéines ribosomiques conservées, les valeurs de bootstrap ultrarapide de 100 % sont indiquées par des cercles bleus. Les étiquettes taxonomiques sont colorées selon l'identité de la famille GTDB [47], Nitrosocaldaceae-rouge, Nitrosopumilaceae-bleu, Nitrososphaeraceae-orange. Les clades/organismes en gras ont été inclus dans l'analyse synténique. Les clades sont nommés selon Alves et al. (2018) [34]. À droite : représentation des schémas synténiques généraux dans différents clades d'AOA. Les écarts entre les gènes d'un même contig sont marqués par une ligne en zigzag. Une double barre oblique indique des contigs séparés. Les nombres sous les lignes en zigzag représentent le nombre de gènes entre les gènes de la sous-unité amo. Une analyse plus fine et une liste complète des espèces peuvent être trouvées dans la Fig. S11 et l'ensemble de données supplémentaire 2, respectivement.

L'émergence des Nitrosopumilaceae s'est accompagnée d'une séparation de cette région génomique en un cluster primaire contenant amoABCX et un cluster secondaire contenant amoYZ (Fig. 3). Au sein de Nitrosotalea sp., Ces grappes sont séparées de 11 à 12 gènes, tandis que le reste des espèces de Nitrosopumilaceae ont ces grappes séparées de seulement 1 à 2 gènes (à l'exception du symbiote éponge Ca. Cenarchaeum symbiosum ). L'émergence de la famille des Nitrososphaeraceae a conduit à une dispersion de tous les gènes de sous-unités à travers le génome à l'exception d'amoA et d'amoX, qui sont généralement liés.

Bien qu'amoZ ait été identifié dans l'analyse génomique, la protéine AmoZ (NVIE_004550) n'était pas corrélée avec AmoABC dans le gel BN-PAGE de N. viennensis. Lors de l'examen du profil d'abondance relative pour AmoZ, le schéma général des pics de peptides AMO a été suivi. Cependant, cela n'a pas été détecté dans l'analyse de corrélation en raison d'un pic d'abondance relative élevé se produisant au bas du gel culminant à la dernière bande prise à environ 66 kDa sur la base de l'échelle BN-PAGE (Fig. 1A). Ceci est supérieur à la masse prédite de 12,8 kDa, mais suggère qu'AmoZ pourrait également faire partie de l'AMO, mais une association plus faible pourrait conduire à sa dissociation du complexe et à sa migration vers le bas du gel.

Pour tester la composition du complexe AMO en dehors du contexte de N. viennensis, l'approche BN-PAGE a été appliquée à des fractions protéiques membranaires de N. cavascurensis, une espèce AOA thermophile lointainement apparentée de la famille des Nitrosocaldaceae [48] récemment obtenue en culture pure (Melcher et al. en préparation). Bien qu'un schéma légèrement différent de complexes ait été obtenu (Fig. 1B), une corrélation des sous-unités supplémentaires a également été observée avec AmoA, AmoB et AmoC dans cet organisme thermophile (corrélation de Kendall des protéines, telle que réalisée pour N. viennensis). Les trois protéines AmoX, NCAV_0488 (AmoY) et NCAV_0486 (AmoZ) avaient toutes des schémas de migration dans le gel fortement corrélés avec AmoABC (tableau 1). Cette analyse a confirmé que les sous-unités proposées étaient traduites dans N. cavascurensis et avaient potentiellement une connexion physique au sein du complexe AMO.

Pour estimer la proximité physique des sous-unités proposées avec les sous-unités connues et d'autres protéines dans le gel BN-PAGE, une réticulation dans le gel [43] a été réalisée à l'aide de l'agent de réticulation disuccinimidyl sulfoxyde (DSSO) sur une découpe BN-PAGE supplémentaire de la bande 7 (Fig. S1B). La spectrométrie de masse et l'analyse de réticulation ont montré de multiples réticulations entre AmoA, AmoB, AmoC et AmoX ainsi qu'avec les deux sous-unités nouvellement proposées AmoY et AmoZ (Fig. 4C). De nombreuses liaisons croisées ont également été connectées à NVIE_016740, une protéine putative de la couche S qui représente probablement une protéine de couche de surface très abondante connue d'autres archées (SlaA) [52, 53]. Comme cette protéine aide vraisemblablement à établir le pseudo-périplasme dans l'AOA, il n'est pas surprenant de la trouver fortement réticulée aux protéines membranaires.

A, B Représentations de dessins animés des modèles de structure AlphaFold des hexamères N. viennensis (A) et N. cavascurensis (B), indiquant leur orientation membranaire putative basée sur l'analyse de l'hydropathie de séquence. Les sous-unités sont colorées comme suit : AmoA, gris clair ; AmoB, noir; AmoC, saumon ; AmoX, lavande; AmoY, cyan; AmoZ, bleu. Les résidus dans les sites de cuivre CuB et CuC sont représentés en bâtonnets rouges. Les liaisons disulfure sont indiquées en jaune. C Représentation des liens croisés identifiés entre les sous-unités AMO existantes et proposées d'une bande AMO coupée d'un gel BN-PAGE de N. viennensis. Vert : sous-unités suspectées sur la base de la génomique comparative. Bleu : sous-unités nouvellement proposées basées sur la corrélation BN-PAGE et l'analyse synténique. D Liens croisés dans le seuil de distance de surface accessible au solvant (SASD) pour DSSO, représenté en vert, cartographié sur le modèle N. viennensis AlphaFold. La seule réticulation observée entre les sous-unités AmoZ et AmoB est représentée en magenta, car elle viole les critères de distance SASD (50,0 Å) mais se situe dans la plage de distance euclidienne (31,8 Å). E Distribution des distances SASD et euclidiennes Cα – Cα des liens croisés DSSO uniques identifiés avec Annika et MeroX. Vingt-sept des 67 liens croisés uniques satisfont aux critères de distance (SASD < 35,0 Å). F Pourcentage de combinaisons de sous-unités réticulées.

AmoX avait également des liens croisés individuels avec plusieurs autres protéines (ensemble de données supplémentaire 1). Comme seules des connexions uniques ont été trouvées et que ces protéines n'apparaissent dans aucune autre analyse synténique ou corrélative, elles n'ont pas été considérées comme représentant un rôle structurel dans le complexe AMO. Ces liaisons croisées peuvent plutôt être attribuées à la grande abondance de ces protéines dans la membrane cellulaire.

Les études transcriptomiques disponibles de l'AOA ont été inspectées pour déterminer si les schémas d'expression des sous-unités nouvellement prédites corroboraient leur implication dans l'AMO. Une étude récente sur la limitation du cuivre chez N. viennensis [54] a confirmé que les gènes amoA, amoB et amoC ont certains des niveaux de transcription les plus élevés dans la cellule, comme le montrent également des études antérieures [55,56,57]. Une analyse de regroupement du même ensemble de données a révélé que amoA, amoB, amoC, amoX, amoY et amoZ semblent tous être co-régulés et tombent dans les grappes contenant les gènes les plus exprimés. (Fig. S2; Ensemble de données supplémentaire 2). Alors que des séquences promotrices transcriptionnelles putatives peuvent être identifiées pour la plupart des gènes amo, un motif de promoteur conservé évident pour les six gènes n'a pas été identifié.

Une réévaluation de ces données transcriptomiques (voir Méthodes) a également révélé que l'amoC6 était l'homologue de l'amoC principalement transcrit (Fig. 5), confirmant ainsi l'identification d'un peptide AmoC6 unique à partir d'une bande Tricine-SDS-PAGE digérée avec de la chymotrypsine (Discussion supplémentaire ; Ensemble de données supplémentaire 1). Ensemble, cela indique qu'AmoC6 est le principal homologue structurel d'AmoC dans le complexe AMO de N. viennensis, du moins dans les conditions de croissance appliquées.

Représentation génomique de N. viennensis montrant l'emplacement des gènes amo et les valeurs moyennes de transcrit transformé log2 par million (TPM) à partir de conditions remplies de cuivre dans Reyes et al. (2020) [54]. Les barres oranges sur le génome indiquent les emplacements des gènes de la sous-unité AMO qui sont fortement exprimés. Les barres bleues sur le génome indiquent les gènes amo qui ont une faible activité transcriptionnelle. Les cases montrent les gènes amo (en gras) et les voisins immédiats colorés sur la base de l'expression génique moyenne à partir de cultures remplies de cuivre. Le rouge indique une expression forte tandis que le bleu représente une expression faible ou absente. Tous les gènes amo fortement exprimés ont été trouvés dans des grappes de gènes hautement exprimés dans des conditions limitées et pleines (voir Fig. S2).

La transcriptomique de la souche marine Nitrosopumilus maritimus a également montré une expression élevée d'amoA, amoB, amoC, amoX et amoY (Nmar_1506). Le gène amoZ (Nmar_1507), bien que synténique avec amoY, présentait des niveaux d'expression plus faibles [ 55 ].

Les trois sous-unités AMO nouvellement proposées ont également été inspectées dans des ensembles de données protéomiques qui ont été générés avec des méthodes permettant une meilleure récupération des protéines membranaires. Les six sous-unités connues et proposées ont été trouvées dans les fractions membranaires de N. viennensis d'une étude précédente [15] ainsi que dans le protéome de N. maritimus [55]. Dans d'autres études protéomiques de l'AOA [58, 59], les trois nouvelles sous-unités n'étaient pas toujours présentes, probablement en raison de leur petite taille et du nombre limité de sites de clivage de la trypsine.

Comme observé précédemment [60], les comparaisons des séquences d'acides aminés des trois sous-unités AMOA, AMOB et AMOC d'Archaea avec celles des bactéries indiquent que les principales différences sont les principales hélices transmembranaires archéennes, au moins une partie de l'amob et une bacoB (figurent. 5). Ces observations sont également valables pour le nouveau clade d'AMO archées récemment découvert dans le phylum Thermoplasmata [61]. Une recherche HMMER utilisant les régions étendues des homologues bactériens contre les génomes d'AOA collectés n'a révélé aucune similitude significative. Par conséquent, une recherche structurelle générale à l'aide de Phobius [62] a été effectuée avec le génome de N. viennensis pour rechercher des gènes pouvant coder une protéine avec les critères suivants : (i) 1 à 3 hélices transmembranaires, (ii) conservation sur tous les AOA [46], et (iii) présent dans les 100 meilleurs gènes transcrits [54] (niveaux similaires aux sous-unités AMO primaires). Cela a révélé six candidats possibles (tableau 2). Les seuls candidats à répondre aux exigences structurelles tout en maintenant des modèles de migration synténiques et similaires dans BN-PAGE étaient amoX, amoY et amoZ.

L'ajout des trois sous-unités proposées dans les archées augmente le nombre d'hélices transmembranaires de 10-11 à environ 14 par protomère, ce qui le rend comparable au nombre trouvé dans les structures cristallines bactériennes de pMMO où chaque protomère du trimère (c'est-à-dire une unité de PmoABC), contient 14-15 hélices transmembranaires [23, 63].

Pour mieux comprendre le contexte structurel du complexe archaeal AMO à la lumière de trois sous-unités supplémentaires proposées, un modèle structurel pour l'organisation du complexe N. viennensis AMO a été obtenu en utilisant la version multimère d'AlphaFold 2.1 [64,65,66]. Les modèles résultants étaient tous similaires et représentaient des prédictions fiables (modèle supérieur, pLDDT = 71,4 et score ptm = 0,668). Toutes les hélices transmembranaires prédites d'AmoX, AmoY et AmoZ jouent un rôle dans l'ancrage du complexe dans la membrane avec les hélices transmembranaires d'AmoA, AmoB et AmoC (Fig. 4A). De plus, il était prévu que le domaine N-terminal d'AmoZ contienne deux hélices alpha qui interagissent avec le domaine N-terminal d'AmoB, remplaçant ainsi éventuellement le rôle du domaine soluble C-terminal manquant trouvé dans PmoB et offrant la dernière pièce du complexe manquant dans les archées (informations supplémentaires dans la discussion supplémentaire). Une liaison disulfure a également été prédite pour se former dans le domaine soluble d'AmoZ. La structure globale est comparable à un protomère du complexe pMMO (Fig. S6).

Pour comparer le degré de conservation de l'organisation hexamérique prédite du complexe AMO, un modèle structurel du complexe AMO de N. cavascurensis a également été obtenu (Fig. 4B). Les modèles résultants étaient similaires dans leur disposition globale les uns aux autres et au modèle N. viennensis, avec des scores de confiance globaux élevés (modèle supérieur, pLDDT = 77,7 et score ptm = 0,591). Les différences entre les modèles N. viennensis et N. cavascurensis incluent la localisation de l'hélice transmembranaire (TM) d'AmoZ. Chez N. viennensis, l'hélice TM devrait interagir principalement avec l'hélice TM d'AmoY, tandis que chez N. cavascurensis, elle devrait interagir avec les TM d'AmoB et d'AmoA (Figs. 4A, B, S7A, C). Cela affecterait le positionnement relatif du domaine N-terminal d'AmoZ par rapport au domaine soluble AmoB, permettant une conformation plus "ouverte". Cependant, la boucle étendue reliant la paire d'hélices N-terminale dans AmoZ au domaine TM permet théoriquement une certaine flexibilité (informations supplémentaires dans la discussion supplémentaire, Fig. S8).

Les données des expériences de réticulation chez N. viennensis ont été cartographiées sur le modèle prédit et ont fortement soutenu les interactions prédites (Fig. 4D) à quelques exceptions près. Sur 67 liaisons croisées uniques observées, 27 (40%) satisfaisaient à un seuil de distance de surface accessible au solvant (SASD) ≤ 35 Å (Fig. 4E) et impliquaient toutes les combinaisons de sous-unités à l'exception d'AmoZ (Fig. 4F). AmoZ n'a participé qu'à des interactions de réticulation> 35 Å, ce qui prend en charge une association plus faible avec le complexe, comme observé dans les schémas de migration BN-PAGE.

Le complexe AMO archéen est une enzyme clé du métabolisme énergétique de l'AOA qui est fortement exprimée dans tous les organismes oxydant l'ammoniac étudiés et a de grandes implications pour l'environnement en raison de sa présence écrasante dans de nombreux écosystèmes [8,9,10,11,12,13,14, 67]. Le travail ici bénéficie des améliorations récentes dans la culture de l'AOA en cultures continues (Melcher et al. en préparation) et présente de nouvelles preuves biochimiques et génomiques comparatives sur la composition du complexe AMO chez Nitrososphaera viennensis et d'autres AOA qui contrastent avec la composition proposée de ce complexe au sein de l'AOB.

La présente analyse a vérifié qu'AmoX, NVIE_004540 et NVIE_004550 sont tous probablement présents dans le complexe archéen AMO et propose de nommer respectivement NVIE_004540 et NVIE_004550 comme AmoY et AmoZ. Cette découverte est basée sur une foule d'analyses indépendantes, y compris des approches protéomiques, génomiques, transcriptomiques, structurelles et de modélisation. La présence de six sous-unités au lieu de trois est unique au domaine des archées et pourrait représenter une stratégie de régulation plus complexe pour le complexe AMO chez les archées. Les différences dans la voie d'oxydation de l'ammoniac sont déjà bien établies entre les domaines archéens et bactériens (c.-à-d., deuxième étape non résolue chez les archées [19, 21]; cytochromes c à base de fer [68, 69] et ubiquinone chez les bactéries [70, 71] vs plastocyanines à base de cuivre [15, 16] et ménaquinone chez les archées [72]). Les caractéristiques variables au sein du complexe AMO observées dans ce travail soulignent davantage ces différences et s'ajoutent à un nombre croissant de preuves que l'AOA et l'AOB participent à la nitrification sous différentes contraintes environnementales et/ou fonctionnelles.

Dans les gels de protéines PAGE natives bleues, le complexe AMO de N. viennensis et de Nitrosocaldus cavascurensis a migré bien au-dessus de la hauteur prévue d'un complexe de protomère trimérique, même en tenant compte des sous-unités supplémentaires (poids moléculaire prévu d'un complexe homotrimère avec six sous-unités par protomère : 296,9 kDa N. viennensis ; 305,1 kDa N. cavascurensis). Les bandes AMO archées sont également observées à un poids moléculaire plus élevé dans le gel par rapport au complexe PMO bactérien homologue d'une espèce de Methylomirabilis qui a également été extrait à l'aide de n-dodécyl-β-D-maltoside (DDM) [73]. Cela pourrait s'expliquer par des différences de composition membranaire des souches ou des différences potentielles d'oligomérisation du protomère. L'AOA contient des lipides uniques liés à l'éther (c'est-à-dire des crénarchaeols) [37, 74, 75, 76, 77, 78] et repose sur une couche S protéique plutôt que sur une membrane externe pour créer un espace pseudo-périplasmique [52, 53]. L'observation de trois pics distincts d'AMO peut très probablement s'expliquer par la co-migration avec d'autres protéines ou complexes avec lesquels elle pourrait interagir physiquement, en particulier avec la protéine de la couche S.

Des travaux antérieurs sur des bactéries qui dépendent des CuMMO ont identifié d'autres protéines putatives impliquées dans le complexe. Les transcrits monocistroniques contenant amoABC de l'AOB Nitrosococcus oceani ATCC 19707 contenaient deux gènes supplémentaires attribués comme amoR et amoD [79]. Le gène amoR s'est avéré être uniquement présent dans Nitrosococcus et n'a donc pas été considéré comme une partie conservée de l'AMO bactérienne. Une étude récente a indiqué que AmoD/PmoD (et probablement l'AmoE homologue) jouent un rôle crucial dans l'homéostasie du cuivre, mais ils ne sont pas soupçonnés d'être une partie structurelle d'un complexe CuMMO [80]. Au contraire, les structures cristallines et cryo-EM du PMO bactérien ont systématiquement confirmé une structure de protomère trimérique avec une sous-unité de PmoA, PmoB et PmoC constituant chaque protomère [22, 23, 24, 25, 26, 27, 28].

Bien qu'il y ait un débat sur la sous-unité qui abrite le site actif principal dans les complexes CuMMO, il existe des preuves claires que le ou les sites métalliques de PmoC jouent un rôle critique dans le complexe de méthanotrophes [27, 28, 31, 32]. Alors que l'AmoC archéen manque d'une section substantielle trouvée dans toutes les bactéries qui correspond à deux hélices transmembranaires (Fig. S5), le site métallique observé dans les structures cristallines antérieures ainsi que le site métallique nouvellement proposé identifié via cryo-EM [28], sont conservés à travers toutes les espèces archéales et bactériennes (Fig. S5). L'importance de cette sous-unité est également étayée par des études de mutagenèse dirigée sur les actinobactéries génétiquement traitables qui contiennent la monooxygénase hydrocarbonée homologue [32].

Le modèle de sol AOA, N. viennensis, comme la plupart des autres AOA vivant dans le sol de la famille des Nitrososphaeraceae, code plusieurs homologues du gène amoC tout en ne conservant que des copies uniques d'amoA et d'amoB [15] (Ensemble de données supplémentaire 2). Des copies supplémentaires d'amoC qui sont spatialement déconnectées de l'opéron AMO sont codées par certains AOB terrestres et ont été impliquées dans la réponse au stress sur la base d'études transcriptionnelles [81, 82]. Au sein des Nitrososphaeraceae, il n'existe aucun opéron AMO conservé (Fig. 3). Des duplications du gène amoC (spatialement distant des autres gènes AMO) se produisent également chez certaines espèces de la famille marine associée AOA (Nitrosopumilaceae) et dans deux MAG de thermophiles AOA (Nitrosocaldaceae), tous découverts dans les sédiments [51, 83, 84]. Une duplication d'amoC est également trouvée dans un symbiote d'éponge AOA et des copies d'amoC archées sont même trouvées dans des virus marins [85]. Ces découvertes peuvent indiquer ensemble l'importance métabolique de la sous-unité AmoC pour les adaptations écophysiologiques dans l'oxydation de l'ammoniac. Bien que ce travail ait identifié un AmoC particulier (AmoC6; NVIE_028540) comme étant l'homologue principal au sein du complexe de N. viennensis, il est possible que (certaines des) autres sous-unités AmoC, issues de duplications de gènes au niveau du genre (Fig. S9), pourrait être incorporé dans certaines conditions environnementales et fournir différents profils d'activité à l'enzyme.

Au-delà de la génomique comparative, la seule information structurelle confirmée pour les archées provient de la structure cristalline d'un AmoB exprimé de manière hétérologue provenant de Candidatus Nitrosocaldus yellowstonensis [86]. Cette structure a confirmé l'absence du domaine cuprédoxine C-terminal et a révélé une région d'acides aminés étendue introuvable chez les bactéries composée de deux hélices et de deux boucles. Il a été proposé que cette région supplémentaire pourrait aider à stabiliser le domaine cuprédoxine existant car les interactions de soutien font défaut en raison de l'absence du domaine C-terminal. Cependant, cette extension d'acides aminés ne se trouve que dans le genre proposé de Nitrosocaldus (Fig. S4). Il est plus probable que le domaine soluble d'AmoZ, qui est conservé dans tous les AOA, confère ce rôle stabilisateur.

En l'absence d'analyses structure-fonction supplémentaires, il n'est pas clair si les sous-unités supplémentaires du complexe archéen reflètent simplement la grande distance évolutive par rapport à tous les autres complexes protéiques connus de la famille CuMMO [34], ou si cette différence de structure a également des implications fonctionnelles pertinentes. Par exemple, les complexes AMO bactériens sont des enzymes de promiscuité capables d'oxyder le méthane et d'autres composés [87,88,89,90]. De telles investigations sur des substrats alternatifs n'ont pas encore été réalisées avec le complexe archéen mais seraient importantes pour évaluer le rôle fonctionnel des archées (et éventuellement des nouvelles sous-unités) dans l'environnement. De plus, des différences dans le complexe AMO entre les espèces AOA ont été identifiées qui ont le potentiel d'affecter la fonction du complexe AMO. Cela inclut la boucle AmoB supplémentaire trouvée dans Nitrosocaldus, mais est également clairement démontrée par la sous-unité AmoZ nouvellement proposée. Le genre Nitrososphaera et la famille des Nitrosocaldaceae (tous deux étudiés dans cette étude) devraient former une liaison disulfure reliant les deux hélices alpha constituant le domaine soluble d'AmoZ (Figs. S7B, D, S10C) via deux cystéines qui ne sont pas conservées dans d'autres AOA. De plus, le genre Nitrosocosmicus devrait contenir un domaine de ruban de zinc supplémentaire représenté par quatre résidus de cystéine à l'extrémité C-terminale, résidant vraisemblablement dans le cytoplasme (Fig. S10C). Les observations d'une liaison disulfure et d'un domaine de ruban de zinc dans certaines lignées AOA pourraient être liées à la sensibilité aux espèces réactives de l'oxygène et aux stratégies de régulation uniques, respectivement, et peuvent refléter des modèles d'évolution uniques qui complètent des aspects encore inconnus du métabolisme de ces groupes spécifiques.

Indépendamment des différences spécifiques aux espèces dans les archées, la structure globale des archées prédite, avec les nouvelles sous-unités, reflète la composition connue des protomères bactériens (Fig. S6). La preuve définitive de l'oligomérisation et de l'organisation de ces sous-unités ne sera pas possible tant qu'une structure définitive (c'est-à-dire cristal ou cryo-EM) de l'AMO archéen ne sera pas réalisée. Les sites d'interaction de protomères putatifs dans la structure cryo-EM de Methylococcus capsulatus str Bath (structure PDB 7S4H) [28] semblent se trouver dans la section de PmoB qui manque dans les archées (Fig. S4). Cependant, le placement d'AmoY et d'AmoZ sur les régions externes du protomère pourrait plutôt faciliter ces interactions (Fig. S7). Cela pourrait également expliquer la grande quantité d'interactions violant SASD entre AmoY et AmoZ, car l'analyse ne prend en compte qu'un seul protomère (Fig. 4F). Il est possible que ces interactions se situent plutôt entre des sous-unités d'AmoY et d'AmoZ dans différents protomères. Par conséquent, les modèles de protomères prédits de N. viennensis et N. cavascurensis n'excluent pas la possibilité d'un complexe AMO archéen trimérique. En ce qui concerne l'orientation, l'approche de modélisation actuelle n'est pas en mesure de prédire exactement comment l'AMO archéen se trouve dans la membrane. Cependant, il est probable que le site actif ainsi que les domaines solubles AmoB et AmoZ soient situés vers l'espace pseudo-périplasmique. Ceci est soutenu par les efforts de modélisation antérieurs du transport des nutriments dans la couche S de l'AOA [91] ainsi que par le marquage immunogold basé sur l'activité des complexes CuMMO dans l'AOB et les méthanotrophes [92].

En conclusion, cette étude fournit des preuves grâce à des données génomiques, protéomiques et transcriptomiques de la présence d'AmoX et de l'inclusion d'AmoY et d'AmoZ en tant que sous-unités dans le complexe AMO archéen. Un seul protomère de l'archée AMO serait donc constitué de six sous-unités au lieu de trois comme dans les autres complexes de la famille CuMMO. L'ajout des nouvelles sous-unités rendrait le nombre d'hélices transmembranaires comparable aux complexes CuMMO trouvés dans les bactéries. Comme l'ancrage de pMMO dans la membrane s'est déjà révélé critique pour son activité [26, 28], il semble plausible que les sous-unités nouvellement identifiées jouent un rôle important pour l'intégrité structurelle et fonctionnelle du complexe archaeal AMO. La présence d'un domaine soluble dans AmoZ qui pourrait remplacer la fonction stabilisatrice du domaine soluble manquant dans AmoB remplit également une pièce manquante potentiellement cruciale du complexe AMO. Étant donné que AmoXYZ semble avoir des rôles structurels importants, il sera impératif d'inclure toutes les sous-unités dans les futures études d'expression et structurelles de ce complexe protéique pertinent pour l'environnement chez les archées. Compte tenu de la large distribution de l'AOA dans pratiquement tous les écosystèmes [8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 34] et de leur pertinence écologique, le développement d'outils génétiques pour l'AOA et l'amélioration de leur production de biomasse seront nécessaires pour permettre une analyse structure-fonction et pour élucider la voie complète de l'oxydation de l'ammoniac dans ces archées.

Toutes les données protéomiques ont été déposées auprès du Consortium ProteomeXchange via le référentiel partenaire PRIDE [44] avec les identifiants PXD035349, PXD034632 et PXD034475 pour BN-Page de N. viennensis, BN-PAGE de N. cavascurensis et des échantillons réticulés, respectivement. Les scripts et le code pertinents pour l'analyse des données peuvent être trouvés dans le référentiel GitHub https://github.com/hodgskiss/Archaeal_AMO.

Une correction à cet article a été publiée : https://doi.org/10.1038/s41396-023-01403-2

Wong-Chong GM, Loehr RC. La cinétique de la nitrification microbienne. Eau Rés. 1975;9:1099–106.

Article CAS Google Scholar

Hyman MR, Bois PM. Inactivation suicidaire et marquage de l'ammoniac monooxygénase par l'acétylène. Biochem J. 1985;227:719–25.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hollocher TC, Tate ME, Nicholas DJ. Oxydation de l'ammoniac par Nitrosomonas europaea. Preuve définitive du traceur 18O que la formation d'hydroxylamine implique une monooxygénase. J Biol Chem. 1981;256:10834–6.

Article CAS PubMed Google Scholar

Winogradsky S. Recherches sur les organismes de la nitrification. Ann Inst Pateur. 1890;4:213–31.

Google Scholar

Könneke M, Bernhard AE, De La Torre JR, Walker CB, Waterbury JB, Stahl DA. Isolement d'un archéon marin autotrophe oxydant l'ammoniac. Nature. 2005;437 :543–6.

Article PubMed Google Scholar

Treusch AH, Leininger S, Kietzin A, Schuster SC, Klenk HP, Schleper C. De nouveaux gènes pour la nitrite réductase et les protéines liées à l'Amo indiquent un rôle des crenarchaeota mésophiles non cultivés dans le cycle de l'azote. Environ Microbiol. 2005;7:1985–95.

Article CAS PubMed Google Scholar

Venter JC, Remington K, Heidelberg JF, Halpern AL, Rusch D, Eisen JA, et al. Séquençage shotgun du génome environnemental de la mer des Sargasses. Science. 2004;304:66–74.

Article CAS PubMed Google Scholar

Leininger S, Urich T, Schloter M, Schwark L, Qi J, Nicol GW, et al. Les archées prédominent parmi les procaryotes oxydant l'ammoniac dans les sols. Nature. 2006;442 :806–9.

Article CAS PubMed Google Scholar

Nicol GW, Leininger S, Schleper C, Prosser JI. L'influence du pH du sol sur la diversité, l'abondance et l'activité transcriptionnelle des archées et bactéries oxydant l'ammoniac. Environ Microbiol. 2008;10:2966–78.

Article CAS PubMed Google Scholar

Adair KL, Schwartz E. Preuve que les archées oxydant l'ammoniac sont plus abondantes que les bactéries oxydant l'ammoniac dans les sols semi-arides du nord de l'Arizona, aux États-Unis. Micro Écol. 2008 ; 56 : 420–6.

Article CAS Google Scholar

Karner MB, Delong EF, Karl DM. Dominance archéenne dans la zone mésopélagique de l'océan Pacifique. Nature. 2001;409:507–10.

Article CAS PubMed Google Scholar

Shi Y, Tyson GW, Eppley JM, Delong EF. Analyses métatranscriptomiques et métagénomiques intégrées d'assemblages microbiens stratifiés en haute mer. ISME J. 2011;5:999–1013.

Article CAS PubMed Google Scholar

Baker BJ, Lesniewski RA, Dick GJ. La transcriptomique activée par le génome révèle des populations d'archées qui entraînent la nitrification dans un panache hydrothermal en haute mer. ISME J. 2012;6:2269–79.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hollibaugh JT, Gifford S, Sharma S, Bano N, Moran MA. Analyse métatranscriptomique d'organismes oxydant l'ammoniac dans un assemblage de bactérioplancton estuarien. ISME J. 2011;5:866–78.

Article CAS PubMed Google Scholar

Kerou M, Offre P, Valledor L, Abby SS, Melcher M, Nagler M, et al. La protéomique et la génomique comparative de Nitrososphaera viennensis révèlent le génome central et les adaptations des oxydants d'ammoniac archéens. Proc Natl Acad Sci USA. 2016;113:E7937–46.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Walker CB , De La Torre JR , Klotz MG , Urakawa H , Pinel N , Arp DJ , et al. Le génome de Nitrosopumilus maritimus révèle des mécanismes uniques de nitrification et d'autotrophie dans les crenarchaea marines distribuées à l'échelle mondiale. Proc Natl Acad Sci USA. 2010;107:8818–23.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Berg IA, Kockelkorn D, Buckel W, Fuchs G. Une voie d'assimilation autotrophe du dioxyde de carbone 3-hydroxypropionate 4-hydroxybutyrate chez les archées. Science. 2007;218:1782–6.

Article Google Scholar

Könneke M, Schubert DM, Brown PC, Hügler M, Standfest S, Schwander T, et al. Les archées oxydant l'ammoniac utilisent la voie aérobie la plus économe en énergie pour la fixation du CO2. Proc Natl Acad Sci USA. 2014;111:8239–44.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Lancaster KM, Caranto JD, Majer SH, Smith MA. Bioénergies alternatives : mises à jour et enjeux de la métalloenzymologie de la nitrification. Joule. 2018;2:1–21.

Article Google Scholar

Simon J, Klotz MG. Diversité et évolution des systèmes bioénergétiques impliqués dans les transformations microbiennes des composés azotés. Biochim Biophys Acta - Bioenerg. 2013;1827:114–35.

Article CAS Google Scholar

Kozlowski JA, Stieglmeier M, Schleper C, Klotz MG, Stein LY. Voies et intermédiaires clés nécessaires à la chimiolithotrophie aérobie obligatoire dépendante de l'ammoniac chez les bactéries et les Thaumarchaeota. ISME J. 2016;10:1836–45.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lieberman RL, Rosenzweig AC. Structure cristalline d'une métalloenzyme liée à la membrane qui catalyse l'oxydation biologique du méthane. Nature. 2005;434:177–82.

Article CAS PubMed Google Scholar

Hakemian AS, Kondapalli KC, Telser J, Hoffman BM, Stemmler TL, Rosenzweig AC. Les centres métalliques de la méthane monooxygénase particulaire de Methylosinus trichosporium OB3b. Biochimie. 2008;47:6793–801.

Article CAS PubMed Google Scholar

Smith SM, Rawat S, Telser J, Hoffman BM, Stemmler TL, Rosenzweig AC. Structure cristalline et caractérisation de la méthane monooxygénase particulaire de l'espèce Methylocystis souche M. Biochimie. 2011;50:10231–40.

Article CAS PubMed Google Scholar

Sirajuddin S, Barupala D, Helling S, Marcus K, Stemmler TL, Rosenzweig AC. Effets du zinc sur l'activité et la structure de la méthane monooxygénase particulaire. J Biol Chem. 2014;289:21782–94.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Ro SY, Ross MO, Deng YW, Batelu S, Lawton TJ, Hurley JD, et al. Des micelles aux bicelles : effet de la membrane sur l'activité particulaire de la méthane monooxygénase. J Biol Chem. 2018;293:10457–65.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Chang WH, Lin HH, Tsai IK, Huang SH, Chung SC, Tu IP, et al. Les centres de cuivre dans la structure cryo-EM de la méthane monooxygénase particulaire révèlent la machinerie catalytique de l'oxydation du méthane. J Am Chem Soc. 2021;143:9922–32.

Article CAS PubMed Google Scholar

Koo CW, Tucci FJ, He Y, Rosenzweig AC. Récupération de la structure et de l'activité de la méthane monooxygénase particulaire dans une bicouche lipidique. Science. 2022;375:1287–91.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Balasubramanian R, Smith SM, Rawat S, Yatsunyk LA, Stemmler TL, Rosenzweig AC. Oxydation du méthane par un centre biologique au dicuivre. Nature. 2010 ;465 : 115–9.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Op den Camp HJM, Islam T, Stott MB, Harhangi HR, Hynes A, Schouten S, et al. Perspectives environnementales, génomiques et taxonomiques sur les verrucomicrobies méthanotrophes. Environ Microbiol Rep. 2009;1:293–306.

Article CAS PubMed Google Scholar

Ross MO, MacMillan F, Wang J, Nisthal A, Lawton TJ, Olafson BD, et al. La méthane monooxygénase particulaire ne contient que des centres de cuivre mononucléaires. Science. 2019;364:566–70.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liew EF, Tong D, Coleman NV, Holmes AJ. La mutagenèse de la monooxygénase hydrocarbonée indique qu'un centre métallique dans la sous-unité C, et non la sous-unité B, est essentiel pour l'activité de la monooxygénase membranaire contenant du cuivre. Microbiologie. 2014;160:1267–77.

Article CAS PubMed Google Scholar

Musiani F, Broll V, Evangelisti E, Ciurli S. La structure modèle de la monooxygénase d'ammoniaque dépendante du cuivre. JBIC J Biol Inorg Chem. 2020;25:995–1007.

Article CAS PubMed Google Scholar

Alves RJE, Minh BQ, Urich T, Von Haeseler A, Schleper C. Unification de la phylogénie mondiale et de la distribution environnementale des archées oxydant l'ammoniac sur la base des gènes amoA. Nat Commun. 2018;9:1517.

Khadka R, Clothier L, Wang L, Lim CK, Klotz MG, Dunfield PF. Histoire évolutive des monooxygénases membranaires de cuivre. Microbiol avant. 2018;9:2493.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Bartossek R, Spang A, Weidler G, Lanzen A, Schleper C. Analyse métagénomique des archées oxydant l'ammoniac affiliées au groupe des sols. Microbiol avant. 2012;3:208.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

De La Torre JR, Walker CB, Ingalls AE, Könneke M, Stahl DA. Culture d'un archéon thermophile oxydant l'ammoniac synthétisant le crénarchéol. Environ Microbiol. 2008;10:810–8.

Article PubMed Google Scholar

Tourna M, Stieglmeier M, Spang A, Könneke M, Schintlmeister A, Urich T. Nitrososphaera viennensis, un archéon oxydant l'ammoniac du sol. Proc Natl Acad Sci USA. 2011;108:8420–5.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wittig I, Braun HP, Schägger H. Blue natif PAGE. Protocole Nat. 2006;1:418–28.

Article CAS PubMed Google Scholar

Reisinger V, Eichacker LA. Solubilisation des complexes de protéines membranaires pour la PAGE native bleue. J Proteom. 2008 ;71 : 277–83.

Article CAS Google Scholar

De Almeida NM, Wessels HJCT, De Graaf RM, Ferousi C, Jetten MSM, Keltjens JT, et al. Systèmes de transport d'électrons liés à la membrane d'une bactérie anammox : une analyse du complexome. Biochim Biophys Acta - Bioenerg. 2016;1857:1694–704.

Article Google Scholar

Berger S, Cabrera-orefice A, Jetten MSM, Brandt U, Welte CU. Étude des complexes protéiques liés au métabolisme énergétique central des archées méthanotrophes ANME-2d par profilage du complexome. BBA - Bioénerg. 2021;1862:148308.

Article CAS Google Scholar

Hevler JF, Lukassen MV, Cabrera‐Orefice A, Arnold S, Pronker MF, Franc V, et al. Réticulation sélective d'assemblages protéiques coïncidents par spectrométrie de masse à réticulation en gel. EMBO J. 2021;40:e106174.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Perez-Riverol Y, Csordas A, Bai J, Bernal-Llinares M, Hewapathirana S, Kundu DJ, et al. La base de données PRIDE et les outils et ressources associés en 2019 : améliorer la prise en charge des données de quantification. Nucleic Acids Res. 2019;47:D442–50.

Article CAS PubMed Google Scholar

Melcher M, Hodgskiss LH, Mardini MA, Schleper C, Rittmann SMKR. Analyse de la productivité de la biomasse et de la physiologie de Nitrososphaera viennensis cultivé en culture continue. Frontières en microbiologie. (en préparation) 14:206.

Abby SS, Kerou M, Schleper C. Les reconstructions ancestrales déchiffrent les principales adaptations des archées oxydant l'ammoniac lors du rayonnement dans des environnements terrestres et marins modérés. MBio. 2020;11:e02371–20.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rinke C, Chuvochina M, Mussig AJ, Chaumeil PA, Davín AA, Waite DW, et al. Une taxonomie archéenne normalisée pour la base de données de taxonomie du génome. Nat Microbiol. 2021;6:946–59.

Article CAS PubMed Google Scholar

Abby SS, Melcher M, Kerou M, Krupovic M, Stieglmeier M, Rossel C, et al. Candidatus Nitrosocaldus cavascurensis, un archéon oxydant l'ammoniac, extrêmement thermophile avec un génome très mobile. Microbiol avant. 2018;9:28.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Nicol GW, Schleper C. Crenarchaeota oxydant l'ammoniac : acteurs importants du cycle de l'azote ? Tendances Microbiol. 2006;14:207–12.

Article CAS PubMed Google Scholar

Sheridan PO, Raguideau S, Quince C, Holden J, Zhang L, Gaze WH, et al. La duplication de gènes entraîne l'expansion du génome dans une lignée majeure de Thaumarchaeota. Nat Commun. 2020;11:5494.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Luo ZH, Narsing Rao MP, Chen H, Hua ZS, Li Q, Hedlund BP, et al. Aperçus génomiques de "Candidatus Nitrosocaldaceae" basés sur neuf nouveaux génomes assemblés par métagénome, dont "Candidatus Nitrosothermus" gen nov. et deux nouvelles espèces de "Candidatus Nitrosocaldus". Microbiol avant. 2021;11:608832.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Stieglmeier M, Klingl A, Alves RJE, Rittmann SKMR, Melcher M, Leisch N, et al. Nitrososphaera viennensis gen. nov., sp. nov., un archéon aérobie et mésophile, oxydant l'ammoniac du sol et membre du phylum archéen Thaumarchaeota. Int J Syst Evol Microbiol. 2014;64:2738–52.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Albers SV, Meyer BH. L'enveloppe des cellules archées. Nat Rev Microbiol. 2011;9:414–26.

Article CAS PubMed Google Scholar

Reyes C, Hodgskiss LH, Kerou M, Pribasnig T, Abby SS, Bayer B, et al. Analyse transcriptomique à l'échelle du génome de l'archéon oxydant l'ammoniac du sol Nitrososphaera viennensis lors de l'exposition à la limitation du cuivre. ISME J. 2020;14:2659–74.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Qin W, Amin SA, Lundeen RA, Heal KR, Martens-Habbena W, Turkarslan S, et al. La réponse au stress d'un archéon marin oxydant l'ammoniac informe sur l'état physiologique des populations environnementales. ISME J. 2017;12:508–19.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Carini P, Dupont CL, Santoro AE. Modèles d'expression des gènes thaumarchéens dans la culture et divers environnements marins. Environ Microbiol. 2018;20:2112–24.

Article CAS PubMed Google Scholar

Stewart FJ, Ulloa O, Delong EF. Métatranscriptomique microbienne dans une zone de minimum permanent d'oxygène marin. Environ Microbiol. 2012;14:23–40.

Article CAS PubMed Google Scholar

Bayer B, Pelikan C, Bittner MJ, Reinthaler T, Könneke M, Herndl GJ, et al. Réponse protéomique de trois archées marines oxydant l'ammoniac au peroxyde d'hydrogène et leurs interactions métaboliques avec une alphaprotéobactérie hétérotrophe. mSystèmes. 2019;4:e00181–19.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Santoro AE, Dupont CL, Richter RA, Craig MT, Carini P, McIlvin MR, et al. Caractérisation génomique et protéomique de 'Candidatus Nitrosopelagicus brevis': un archéon oxydant l'ammoniac du large. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1173–8.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tolar BB, Herrmann J, Bargar JR, van den Bedem H, Wakatsuki S, Francis CA. Biologie structurale intégrée et écologie moléculaire des enzymes à cycle N des archées oxydant l'ammoniac. Environ Microbiol Rep. 2017;9:484–91.

Article PubMed Google Scholar

Diamond S, Lavy A, Crits-Christoph A, Matheus Carnevali PB, Sharrar A, Williams KH, et al. Les sols et les sédiments hébergent Thermoplasmata archaea codant pour de nouvelles monooxygénases membranaires de cuivre (CuMMO). ISME J. 2022;16:1348–62.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Käll L, Krogh A, Sonnhammer ELL. Une topologie transmembranaire combinée et une méthode de prédiction de peptide signal. J Mol Biol. 2004;338:1027–36.

Article PubMed Google Scholar

Hakemian AS, Rosenzweig AC. La biochimie de l'oxydation du méthane. Annu Rev Biochem. 2007;76:223–41.

Article CAS PubMed Google Scholar

Jumper J, Evans R, Pritzel A, Green T, Figurnov M, Ronneberger O, et al. Prédiction très précise de la structure des protéines avec AlphaFold. Nature. 2021;596:583–9.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Varadi M, Anyango S, Deshpande M, Nair S, Natassia C, Yordanova G, et al. Base de données sur la structure des protéines AlphaFold : étend massivement la couverture structurelle de l'espace des séquences protéiques avec des modèles de haute précision. Nucleic Acids Res. 2022;50 :D439–D444.

Article CAS PubMed Google Scholar

Evans R, O'Neill M, Pritzel A, Antropova N, Senior A, Green T, et al. Prédiction du complexe protéique avec AlphaFold-Multimer. bioRxiv. 2022. https://doi.org/10.1101/2021.10.04.463034.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Klotz MG, Stein LY. Génomique des nitrifiants et évolution du cycle de l'azote. FEMS Microbiol Lett. 2008;278:146–56.

Article CAS PubMed Google Scholar

Yamanaka T, Shinra M. Cytochrome c-552 et cytochrome c-554 dérivés de Nitrosomonas europaea. J Biochem. 1974;75:1265–73.

Article CAS PubMed Google Scholar

Arciero DM, Hooper AB, Balny C. Études cinétiques spectroscopiques et rapides de la réduction du cytochrome c554 par l'hydroxylamine oxydoréductase de Nitrosomonas europaea. Biochimie. 1991;30:11466–72.

Article CAS PubMed Google Scholar

Hooper AB, Erickson RH, Terry KR. Systèmes de transport d'électrons de Nitrosomonas : isolement d'une fraction membrane-enveloppe. J Bactériol. 1972;110:430–8.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Whittaker M, Bergmann D, Arciero D, Hooper AB. Transfert d'électrons lors de l'oxydation de l'ammoniac par la bactérie chimiolithotrophe Nitrosomonas europaea. Biochim Biophys Acta - Bioenerg. 2000 ;1459 : 346–55.

Article CAS Google Scholar

Elling FJ, Becker KW, Könneke M, Schröder JM, Kellermann MY, Thomm M, et al. Quinones respiratoires chez Archaea : distribution phylogénétique et application comme biomarqueurs en milieu marin. Environ Microbiol. 2016;18:692–707.

Article CAS PubMed Google Scholar

Versantvoort W, Guerrero-Castillo S, Wessels HJCT, Van Niftrik L, Jetten MSM, Brandt U, et al. Analyse du complexome de l'organisme méthanotrophe Methylomirabilis lanthanide dépendant du nitrite. Biochem Biophys Acta - Bioenerg. 2019;1860:734–44.

Article CAS PubMed Google Scholar

Pitcher A, Rychlik N, Hopmans EC, Spieck E, Rijpstra WIC, Ossebaar J, et al. Le crénarchaeol domine les lipides membranaires de Candidatus Nitrososphaera gargensis, un archéon thermophile du groupe I.1b. ISME J. 2010;4:542–52.

Article CAS PubMed Google Scholar

Villanueva L, Damsté JSS, Schouten S. Une réévaluation de la voie de biosynthèse des lipides membranaires archéens. Nat Rev Microbiol. 2014;12:438–48.

Article CAS PubMed Google Scholar

Sinninghe Damsté JS, Schouten S, Hopmans EC, Van Duin ACT, Geenevasen JAJ. Crenarchaeol : le noyau caractéristique du glycérol dibiphytanyl glycérol lipide membranaire tétraéther des crenarchaeota pélagiques cosmopolites. J Lipid Res. 2002;43:1641–51.

Article Google Scholar

Sinninghe Damsté JS, Rijpstra WIC, Hopmans EC, Jung MY, Kim JG, Rhee SK, et al. Lipides intacts polaires et centraux de glycérol dibiphytanyl glycérol tétraéther des groupes I.1a et I.1b Thaumarchaeota dans le sol. Appl Environ Microbiol. 2012;78:6866–74.

Article PubMed Central Google Scholar

Elling FJ, Könneke M, Mußmann M, Greve A, Hinrichs KU. Influence de la température, du pH et de la salinité sur la composition lipidique membranaire et le TEX86 des isolats thaumarchés planctoniques marins. Geochim Cosmochim Acta. 2015;171:238–55.

Article CAS Google Scholar

El Sheikh AF, Poret-Peterson AT, Klotz MG. Caractérisation de deux nouveaux gènes, amoR et amoD, dans l'opéron amo de l'oxydant d'ammoniac marin Nitrosococcus oceani ATCC 19707. Appl Environ Microbiol. 2008;74:312–8.

Article CAS PubMed Google Scholar

Fisher OS, Kenney GE, Ross MO, Ro SY, Lemma BE, Batelu S, et al. Caractérisation d'une protéine de cuivre longtemps négligée à partir de bactéries oxydant le méthane et l'ammoniac. Nat Commun. 2018;9:4276.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Berube PM, Samudrala R, Stahl DA. La transcription de toutes les copies d'amoC est associée à la récupération de Nitrosomonas europaea après une privation d'ammoniac. J Bactériol. 2007;189:3935–44.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bérubé PM, Stahl DA. La sous-unité divergente AmoC3 de l'ammoniac monooxygénase fonctionne dans le cadre d'un système de réponse au stress chez Nitrosomonas europaea. J Bactériol. 2012;194:3448–56.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lebedeva EV, Hatzenpichler R, Pelletier E, Schuster N, Hauzmayer S, Bulaev A, et al. Enrichissement et séquence du génome de l'archéon oxydant l'ammoniac du groupe I.1a 'Ca. Nitrosotenuis uzonensis' représentant un clade globalement distribué dans les habitats thermiques. PLoS One. 2013;8:e80835.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Qin W, Heal KR, Ramdasi R, Kobelt JN, Martens-Habbena W, Bertagnolli AD, et al. Nitrosopumilus maritimus gén. nov., sp. nov., Nitrosopumilus cobalaminigenes sp. nov., Nitrosopumilus oxyclinae sp. nov., et Nitrosopumilus ureiphilus sp. nov., quatre archées marines oxydant l'ammoniac du phylum Thaumarchaeota. Int J Syst Evol Microbiol. 2017;67:5067–79.

Article PubMed Google Scholar

Ahlgren NA, Fuchsman CA, Rocap G, Fuhrman JA. Découverte de plusieurs virus Thaumarchaeota marins nouveaux, répandus et écologiquement distincts qui codent pour les gènes de nitrification amoC. ISME J. 2019;13:618–31.

Article CAS PubMed Google Scholar

Lawton TJ, Ham J, Sun T, Rosenzweig AC. Conservation structurale de la sous-unité B dans la superfamille de l'ammoniac monooxygénase/particule méthane monooxygénase. Protéines. 2014;82:2263–7.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hyman MR, Bois PM. Oxydation du méthane par Nitrosomonas europaea. Biochem J. 1983;212:31–37.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hyman MR, Bois PM. Oxydation de l'éthylène par Nitrosomonas europaea. Arch Microbiol. 1984;137:155–8.

Article CAS Google Scholar

Hyman MR, Murton IB, Arp DJ. Interaction de l'ammoniac monooxygénase de Nitrosomonas europaea avec des alcanes, des alcènes et des alcynes. Appl Environ Microbiol. 1988;54:3187–90.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jones RD, Morita RY. Oxydation du méthane par Nitrosococcus oceanus et Nitrosomonas europaea. Appl Environ Microbiol. 1983;45:401–10.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li P, Herrmann J, Tolar BB, Poitevin F, Ramdasi R, Bargar JR, et al. Le transport des nutriments suggère une base évolutive pour les protéines chargées de la couche superficielle des archées. ISME J. 2018;12:2389–402.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sakoula D, Smith GJ, Frank J, Mesman RJ, Kop LFM, Blom P, et al. Méthode universelle de marquage basée sur l'activité pour les bactéries oxydant l'ammoniac et les alcanes. ISME J. 2022;16:958–71.

Article CAS PubMed Google Scholar

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Nous remercions Anas Mohammed Mardini pour son excellente assistance technique dans la culture de N. viennensis et Wolfram Weckwerth pour sa précieuse contribution aux discussions initiales du projet. Nous remercions également Florian Sikora et le Dr Boris Görke pour l'assistance technique et l'utilisation de la machine OneShot pour la lyse cellulaire et le Dr Stephanie Eichorst pour l'assistance et l'utilisation de l'ultracentrifugeuse. Nous remercions également le Dr Thomas Rattei, Florian Goldenberg et Johann Dorn de la Division de la biologie des systèmes computationnels (CUBE) pour avoir assuré la maintenance et l'accès au Life Science Computer Cluster (LiSC) de l'Université de Vienne.

Ce projet a été soutenu par Doktoratskolleg (DK) plus : Cycle de l'azote microbien - des cellules individuelles aux écosystèmes (Austrian Science Fund W1257), ERC Advanced Grant TACKLE (n° 695192) et le programme de recherche et d'innovation Horizon 2021-2027 de l'Union européenne dans le cadre de l'accord de subvention n° 101079299.

Archaea Biology and Ecogenomics Unit, Department of Functional and Evolutionary Ecology, Université de Vienne, Vienne, Autriche

Logan H. Hodgskiss, Michael Melcher, Melina Kerou, Rafael I. Ponce-Toledo & Christa Schleper

Installation de spectrométrie de masse, Max Perutz Labs, Vienna BioCenter (VBC), Vienne, Autriche

Weiqiang Chen et Markus Hartl

VIB Center for Inflammation Center and Department of Biochemistry & Microbiology, Université de Gand, Gand, Belgique

Savvas N. Savvides

Unité de biologie des systèmes moléculaires, Département d'écologie fonctionnelle et évolutive, Université de Vienne, Vienne, Autriche

Stéfanie Wienkoop

Département de biochimie et de biologie cellulaire, Max Perutz Labs, Université de Vienne, Vienne, Autriche

Marcus Hartl

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LHH, MK, SW, MH et CS ont conceptualisé le projet de recherche. L'enquête a été menée par LHH, MK, WC, SNS et RIPT. La production de biomasse a été réalisée par MM. LHH, MK et CS ont rédigé l'article avec des modifications et des contributions de MM, WC, RIPT, SNS, SW et MH.

Correspondance avec Christa Schleper.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

La version originale en ligne de cet article a été révisée : dans cet article, les détails d'affiliation pour Savvas N. Savvides ont été donnés de manière incorrecte. Cela aurait dû être "VIB Center for Inflammation Center and Department of Biochemistry & Microbiology, Ghent University, Gand, Belgium".

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Réimpressions et autorisations

Hodgskiss , LH , Melcher , M , Kerou , M et al. Complexité inattendue de la monooxygénase d'ammoniac chez les archées. ISME J 17, 588–599 (2023). https://doi.org/10.1038/s41396-023-01367-3

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Reçu : 08 juillet 2022

Révisé : 9 janvier 2023

Accepté : 12 janvier 2023

Publié: 31 janvier 2023

Date d'émission : avril 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41396-023-01367-3

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